于涛 孙丽丽

摘要：本文探索了高效液相色譜法检测人纤维蛋白含量的色谱条件，通过对人纤维蛋白溶液紫外光谱的扫描结果，设定不同波长进行比对，并筛选出适合的波长，为开展进一步分析提供理论依据。

关键词：紫外光谱;人纤维蛋白含量;测定

中图分类号： R927                                文献标识码：  A                         DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2019.14.031

高效液相色谱法和氨基酸分析仪是目前蛋白质分析方法中最有效的手段，高效液相色谱法分析原理主要是利用蛋白质的氨基与标识化试剂作柱前或柱后衍生，再进行测定。目前，用于反相高效液相色谱检测氨基酸的柱前衍生试剂近10种，以柱前衍生高效液相色谱法测定纤维蛋白原中的精氨酸也有报道，但其衍生化试剂盒费用高，且需配置荧光检测器。本实验参照 《中国药典》二部（2005版）中高效液相色谱法，采用2，4-二硝基氟苯为柱前衍生剂，以紫外吸收检测器检测不同波长的吸收效果，选出最佳的吸收波长。

1 材料与方法

1.1 样品准备

人纤维蛋白原为BIOSHARP公司产品，规格：100mg/支，Exp：2017/03。

1.2 主要试剂及仪器

磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，乙腈（色谱纯），凝胶色谱柱Shodex KW-802.5，岛津紫外检测器，普析TU-1901型紫外分光光度计。

1.3 流动相及样品溶液的制备

流动相采用乙腈-磷酸盐缓冲溶液，称取磷酸二氢钠9.5g，磷酸氢二钠1.25g，置于500mL容量瓶中，超纯水溶解并定容，另取500mL乙腈与其混合，用0.45μm有机膜过滤。

1.4 样品处理

精密量取样品溶液1mL，加入相对应的流动相乙腈-磷酸盐缓冲液和乙腈-纯水溶液99mL，充分混匀，静止30min，进行蛋白质沉淀，离心5min，取上层清液进行测定。

1.5 色谱条件

采用凝胶色谱柱Shodex KW-802.5（5μm，8*300 mm）;流速1mL/min;波长设定为205nm、215nm、230nm、280nm;柱温40℃;采用岛津LC-15C色谱工作站;进样量20μL。

1.6 实验方法

分别在不同波长下分析蛋白分子保留时间及色谱峰吸收强度，筛选最适合的实验条件。

2 实验结果

扫描紫外光谱，波长200～350nm，结果见图1。

通过扫描紫外光谱可得出蛋白溶液200～230nm内有较强吸收强度，在250～300nm有较弱的吸收强度，故设定检测波长为205nm、215nm、230nm、280nm。

不同吸收波长下检测结果（流动相配比为乙腈：磷酸盐缓冲液=1：1）。

在波长为205nm下进行检测，结果见图2。

由色谱图结果可得出，色谱峰的吸收强度不高，各氨基酸组分分离度≤0.5，色谱峰存在一定拖尾现象，分离效果不理想。

在波长215nm下进行检测，结果见图3。

由色谱图结果可得出，色谱峰的吸收强度较好，各氨基酸组分分离度≥1.5，色谱峰对称性理想，分离效果较为满意。

在波长230nm下进行检测，结果见图4。

由色谱图结果可得出，色谱峰的吸收强度降低，各氨基酸组分分离度≤1，色谱峰对称性不理想，且蛋白组分比例发生明显变化，分离效果不满意，不建议在此波长下分析检测。

在波长280nm下进行检测，结果见图5。

由色谱图结果可得出，色谱峰的吸收强度大幅降低，各氨基酸组分分离度≤0.5，色谱峰对称性很不理想，且蛋白组分无法分离，此波长不适合进行蛋白质的分析检测。

3 结论

本实验建立的色谱方法采用凝胶色谱柱进行分离，通过多次单因素实验，确定在215nm波长下蛋白分子有最佳吸收强度和分离度，通过对此次实验方法条件的摸索，得到最适合吸收波长实验条件，测定结果稳定，有良好的重复性，可直接用于人纤维蛋白含量测定，用于进一步实验研究。

参考文献

[1]尉小平，冉铁成，王坚，赵家宏.柱前衍生反相高效液相色谱法测定冻干人纤维蛋白原制品中盐酸精氨酸和甘氨酸的含量[J].中国生物制品学，2007，21：645-687.

[2]陈通威，高红琴，崔素梅，张惠兰，王宗刚.高效液相色谱法测定人纤维蛋白原中甘氨酸、盐酸精氨酸含量[J].中国药业，2013，31：635-637.

[3]候淑琴，梁小明，黄玲，张惠兰，张丽玲.人纤维蛋白原制剂中蛋白质含量测定方法的探究[J].临床医药实践，2014，21：521-545.

作者简介：于涛，硕士，中级讲师，研究方向：玉米深加工、仪器分析。