余 灿，易绍金

（长江大学化学与环境工程学院，湖北 荆州 434023）

目前，微生物清防蜡技术已广泛应用于油井清防蜡，取得了良好的效果和经济效益［1-5］。油田中的腐蚀给石油生产带来了严重的影响和危害，其中硫酸盐还原菌（SRB）及其代谢产生的硫化氢和S2-是最重要的腐蚀因素之一［6-8］。反硝化菌（DNB）可抑制 SRB 进而达到防止 SRB 的腐蚀已形成共识［9-14］。目前微生物菌剂只能单纯得到清防蜡效果或防腐效果，即投加清防蜡菌剂可对油井起到清防蜡作用，投加DNB 菌剂可通过抑制SRB 从而达到防腐效果。本文采用的清防蜡菌剂为工业用微生物清防蜡菌剂，主要为石油烃降解菌（HDB），也含有少量DNB。通过在清防蜡菌剂中投加硝酸盐，刺激原菌剂中DNB增长，再添加适量DNB菌种，使菌剂中HDB 的数量保持基本稳定的同时，DNB 也能达到一定的数量（1.0×108个/mL 以上），从而形成复合微生物菌剂JH-01，以期实现清防蜡效果的同时兼具防腐效果，达到一剂两用之目的。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

硝酸钠，工业级，襄阳泽东化工集团有限公司；DNB菌种，实验室保藏菌种；微生物清防蜡菌剂，工业级，湖北长大科技开发有限公司；A3 钢片、J55 钢片，常州清立环能化工科技有限公司；HDB-JH型石油烃降解菌测试瓶、DNB-JH型反硝化菌测试瓶，湖北长大科技开发有限公司；江苏油田原油，25℃下的黏度为34.82 mPa·s，凝固点为40℃，含蜡量为21.12%，属于高含蜡量原油；江苏油田现场采出液，矿化度 27774.5 mg/L，Na2SO4水型，SRB 菌数 2.0×104个/mL，SO42-、S2-、Cl-、Na+质量浓度分别为1090.6、12.3、4692.3、9641.1 mg/L；石油烃降解菌液体培养基配方［15］：K2HPO4·3H2O 4.8 g、KH2PO41.5 g、（NH4）2SO41 g、柠檬酸三钠 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、酵母粉 0.1 g、CaCl2·2H2O 0.002 g、蒸馏水1 L、2%液体石蜡、pH=7.2数7.4；反硝化菌液体培养基配方［16］：KNO32 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、酒石酸钾钠20 g、蒸馏水1 L。

THZ-412 恒温振荡器，上海精宏实验设备有限公司；STARTER3100pH 计，奥豪斯仪器设备有限公司；SPX-300BS-Ⅱ生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；13395H2X显微镜，上海徕卡显微系统有限公司。

1.2 实验方法

（1）菌数的测定。采用细菌测试瓶法［17］和最大或然数计数法（MPN）［18］测定菌数。细菌测试瓶法参照石油天然气行业标准SY/T 5329—2012《碎屑岩油藏注水水质推荐指标及分析方法》进行。采用MPN中的双管平行法计数样品中的菌数。

（2）pH值的测定。参照国家标准GB 6920—86《水质pH 值的测定玻璃电极法》，采用玻璃电极法测定pH值。

（3）防蜡率的测定。采用倒扣瓶法测定工业微生物清防蜡菌剂和JH-01 型复合菌剂的防蜡率［19］。取江苏油田原油，以无菌水为空白组，原工业微生物清防蜡菌剂为对照组。

（4）腐蚀速率的测定。参照标准SY/T 5329—2012，采用挂片法测定腐蚀速率。将油田现场采出液（每瓶180 mL）分别与20 mL 无菌水和20 mL 微生物清防蜡剂混合均匀，在35℃和密闭厌氧状态（模拟油井环形空间厌氧环境）下，将A3或J55钢片置于上述混合液中30 d，测定混合液中的SRB菌数和钢片的平均腐蚀速率。

（5）HDB 和DNB 的生理生化特征。将实验室保藏的DNB菌种或清防蜡菌剂中分离提纯的HDB分别用接种环转接到装有50 mL灭菌反硝化液体培养基或灭菌石油烃液体培养基的锥形瓶中，在35℃、150 r/min 下培养24 h。初筛后分别得到4 株DNB 菌株 JHF1数 4 和 5 株 HDB 菌株 JHS1数 5。将菌株通过平板划线法和穿刺培养法培养2 d 后［20］，观察菌落情况；革兰氏染色后观察菌落形态以及菌株生理生化特征。

2 结果与讨论

2.1 工业用微生物清防蜡菌剂中HDB及DNB的菌数检测

用细菌测试瓶法测得工业用微生物清防蜡菌剂中HDB的菌数为2.0×108个/mL，用细菌测试瓶法和MPN 法测得 DNB 的菌数为5.0×102个/mL，说明清防蜡菌剂中主要为HDB，同时存在少量DNB。

2.2 硝酸盐加量对清防蜡菌剂中HDB及DNB菌数的影响

向工业用微生物清防蜡菌剂中加入不同量的硝酸钠，在35℃、150 r/min的条件下摇床培养14 d，测得HDB 和DNB 的菌数见表1。硝酸钠加量小于1.0 g/L 时，HDB 的菌数基本保持不变，具有一定的抗盐性；当硝酸钠加量达到1.0 g/L 以上时，HDB 菌数降低。随硝酸钠加量的增加，DNB的菌数先增加后降低，硝酸钠加量为0.2 g/L 时的DNB 菌数最大。这可能是由于矿化度过高使菌体处于高渗溶液中，细胞皱缩失水，不利于微生物生长，菌数下降［20］。通过加入一定量的硝酸钠虽然能让清防蜡菌剂中的DNB 数量有所增加，但达不到预期效果（1.0×108个/mL以上），因此需要向其中加入DNB菌种以增加清防蜡菌剂中DNB的菌数。

表1 硝酸钠加量对清防蜡菌剂中HDB及DNB菌数的影响

2.3 投加DNB菌种的清防蜡菌剂中HDB及DNB的数量

经预实验并考虑到成本，投加DNB 菌种量为0.2%（体积分数，后同）时即可获得一定数量的DNB。向工业用微生物清防蜡菌剂中投加0.2%DNB 菌种后，再按每100 mL 菌剂加入不同质量的硝酸钠，在35℃、150 r/min的条件下摇床培养14 d，测得HDB 和DNB 的菌数见表2。随硝酸钠加量的增大，HDB 菌数基本保持稳定。当额外投加0.2%DNB 菌种后，随着硝酸钠加量的增大，DNB菌数先增加后降低，在硝酸钠加量为0.2 g/L时达到最大值（2.5×108个/mL），达到了预期效果。矿化度的增加抑制了 DNB 菌体的数量［20］。将投加 0.2% DNB 菌种和0.2 g/L硝酸钠的清防蜡菌剂留存备用，命名为JH-01型复合菌剂。

表2 投加DNB菌种的清防蜡菌剂中HDB及DNB的菌数随硝酸钠加量的变化

2.4 清防蜡菌剂培养过程中pH值的变化及原因分析

分别量取不同硝酸钠加量下，投加0.2% DNB菌种和未投加菌种的清防蜡菌剂50.0 mL，测定菌剂在 35℃、150 r/min 条件下培养 0、48、96、240 h 的pH 值，结果见表3。随着培养时间的延长，投加DNB菌种前后的清防蜡菌剂pH值总体都呈现了下降的趋势。投加0.2% DNB 菌种的清防蜡菌剂pH值降幅小于未投加的降幅。当硝酸钠加量为0.2 g/L 时，培养 96 h 后的 pH 值又回到 7.02。在培养240 h后，未投加DNB菌种的清防蜡菌剂pH值降至5.70 左右，而投加了0.2% DNB 菌种的清防蜡菌剂pH 值基本都回升至初始pH 值。结合HDB 和DNB的代谢特性可知，HDB在代谢过程中会产生低分子有机酸使pH值降低，DNB代谢会利用HDB产生的低分子有机酸使pH值升高。当菌剂中HDB菌数较多而DNB 较少时，随着培养时间的延长，pH 值受HDB 代谢产物的影响导致pH 值下降。pH 值过低或者过高均不利于菌体的正常生长发育。当菌剂中同时存在大量HDB 和大量DNB 时，受HDB 和DNB 的共同影响，菌剂的pH 值保持在一个稳定的水平，这让DNB 和HDB 在数量上保持一个动态平衡。因此从菌剂的pH值变化可以侧面反映出菌剂中各菌体数量的整体趋势。

表3 硝酸钠加量对投加DNB菌种前后清防蜡菌剂pH值的影响

2.5 防蜡效果实验研究

用倒扣瓶法测得原工业微生物清防蜡菌剂（对照组）和JH-01 型复合菌剂（实验组）的防蜡率见表4。原工业用微生物清防蜡剂和JH-01 型复合菌剂的防蜡率均大于80%，防蜡性能良好。

表4 工业微生物清防蜡菌剂的防蜡率

2.6 防腐效果

将油田现场采出液与无菌水（空白组）、原工业用微生物清防蜡剂（对照组）、20 mL JH-01型复合菌剂（实验组）混合后，测得三者对A3和J55钢片的平均腐蚀速率见表5。在密闭厌氧状态下挂片30 d后，对照组中的SRB菌数变化不大，甚至有所增加，双平行样测得的平均腐蚀速率也均大于标准SY/T 5329—2012规定的0.076 mm/a；而实验组的SRB菌数明显降低，平均腐蚀速率均低于0.076 mm/a。表明JH-01 型复合菌剂的投加会减少SRB 菌数，从而降低腐蚀速率。

表5 工业用微生物清防蜡剂对挂片腐蚀速率的影响*

2.7 HDB和DNB的种类及生理生化特征

HDB菌株JHS1数5和DNB菌株JHF1数4的菌落形态和菌株生理生化特征如表6所示。HDB 菌呼吸类型主要为兼性厌氧，同时也有少量的好氧和专性厌氧，大多数不能运动；DNB 菌呼吸类型主要为兼性厌氧，一株为专性厌氧，革兰氏染色均为阴性。清防蜡菌剂中的HDB 与DNB 多为兼性厌氧菌，可以共存于同一环境中。

表6 HDB菌株与DNB菌株的形态及生理生化特征

3 结论

工业用清防蜡菌剂中含有大量的石油烃降解菌（HDB）和少量的反硝化菌（DNB）。向其中投加少量硝酸钠可使DNB 菌数增加，但增幅有限；当硝酸钠加量大于0.2 g/L时，DNB菌数逐渐降低。在工业用清防蜡菌剂中投加0.2%DNB菌种和0.2 g/L的硝酸钠，可得到既具有防蜡效果也具有一定防腐效果的JH-01 型复合菌剂。可通过培养过程中pH 值的变化来判断清防蜡菌剂中HDB和DNB菌数之间的关系。清防蜡菌剂中的HDB与DNB多为兼性厌氧菌，二者兼容性良好。