岑万，林君如，钟佳泽，黄鹭强

（1.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117 2.福建师范大学南方海洋研究院，福建 福州 350117）

海参属棘皮动物门(Echinodermata）海参纲(Holothuriodea)无脊椎动物[1]，目前已知全球约有 1500多种，有经济价值的海参有60多种[2]。海参是一种传统的海珍品，含有丰富多样的生物活性物质[3]，如抗肿瘤物质、抗凝血物质、抗炎症物质等成分[4-6]，具有极高的药用价值和食用价值，长期以来一直受到大众的青睐。

海参的加工品多以海参体壁为主，内脏主要是少量种类的性腺和肠等，同时海参肠也是一些品种海参加工过程中产生的大宗副产物。研究表明海参肠中含有多肽、多糖、酚类、黄酮类物质和矿物质，可清除自由基、抗菌活性、降血脂和血糖、增强免疫力[7]。本文以海参肠为研究对象，采用响应面法研究海参肠的酶解工艺，以期为高值化利用海参提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

海参肠为海参加工副产物，由胜田（福清）食品有限公司提供。

1.2 试剂

木瓜蛋白酶（60000 U/g），广州华琪生物有限公司；

氢氧化钠、柠檬酸、甲醛均为国产分析纯。

1.3 仪器

HC-2066高速离心机，安徽中科中佳；

HH-3A型数显恒温水浴锅，金坛易晨仪器；JJ-2组织捣碎匀浆机，常州国华；pH计，奥豪斯；

KDN-04A凯式定氮仪，上海力辰邦西。

1.4 方法

1.4.1 海参肠酶解工艺流程

海参肠→清洗去沙→组织捣碎→加酶处理→灭酶→冷却离心→酶解液→低温保存

1.4.2 操作步骤

⑴ 清洗：将冰冻的海参肠常温解冻，然后进行清洗，清洗过程中要注意除去沙粒等物质，且避免海参肠自溶。

⑵ 组织捣碎：海参肠剪成小块，捣碎匀浆。

⑶ 酶处理：参考周洁静等[8]方法，准确称取50 g海参肠浆，置于500 mL烧杯中，按一定的料液比加水混匀，放入已恒温的恒温水浴锅中，待料液达到一定温度后加入1 g木瓜蛋白酶。充分搅匀，并调节pH值至一定值。每隔2.5 h加酶一次，水解5 h后终止反应。

⑷ 灭酶：将水解液快速升温至90～100℃，并保持20 min。冷却至室温，在转速为4000 r/min 下离心15 min，所得上清液即为海参酶解液粗产品。通过检测蛋白质水解度来衡量水解效果。

1.4.3 单因素试验

料液比（w∶w）：分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，此时水解温度为55 ℃，pH调至7.0；

pH：分别调至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，此时料液比为1∶2，水解温度为55 ℃；

水解温度：分别为50、55、60、65、70 ℃，此时料液比为1∶2， pH调至7.0。

1.4.4 响应面试验

单因素试验的基础上，分别选取3组料液比、pH值和水解温度，设计三因素三水平响应面试验[9]。通过检测蛋白质水解度来衡量水解效果。

1.4.5 水解度的测定

参考王可琦等[10]方法，采用甲醛滴定法测定海参肠蛋白质的水解度。

1.4.6 结果计算

A--游离氨基氮，mg/mL

V1--两测定管氢氧化钠用量的平均值，mL

V2--空白管氢氧化钠的用量，mL

B--样品体积，mL

M--样品量，g

N--总氮含量

1.4.7 数据分析

本文的数据分析和绘图采用Origin 8.5 软件，响应面实验采用Design-Expert.8.05b软件设计并分析实验结果和绘图。数据均为平均值±标准差（n=3）。柱形图上标有不同字母表示在0.05 水平有显著差异。

表1 水解度测定方案

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对海参肠酶解的影响

根据设定的不同料液比进行海参肠酶解试验，通过甲醛滴定测定获得水解度，结果见图1。

图1 料液比对海参肠酶解水解度的影响

由图1可知，当pH值和水解温度恒定时，随着料液比的升高，海参肠的水解度呈现先升高后下降的趋势。料液比为1∶3时水解度达到最高，料液比从1∶4到1∶6，海参肠的水解度呈下降趋势。

2.1.2 pH值对海参肠酶解的影响

根据设定的不同pH值进行海参肠酶解试验，通过甲醛滴定测定获得水解度，结果见图2。

图2 pH值对海参肠酶解水解度的影响

由图2可知，当料液比和水解温度恒定时，随着pH值的升高海参肠的水解度呈现升高的趋势。pH 5.5～6.5时水解度变化不显著，当pH值达到7.0时水解度达到最高，随后水解度又呈下降趋势。

2.1.3 水解温度对海参肠酶解的影响

根据设定的不同温度进行海参肠酶解试验，通过甲醛滴定测定获得水解度，结果见图3。

图3 水解温度对海参肠酶解水解度的影响

由图3可知，当料液比和pH值恒定时，海参液的水解度随着随着水解温度的升高呈现先升高后下降的趋势。当水解温度达到60 ℃时解度达到最高，水解温度在65～70 ℃海参肠水解度随之下降。

表2 Box-Behnken试验设计与结果

表3 响应面二次模型的方差分析结果

2.2 响应面分析

根据单因素试验结果，参照张晓晓等[11]方法，以料液比、pH值、水解温度为自变量，以水解液的蛋白质水解度为响应值进行响应面试验，其结果见表2。

AVOVA分析结果见表3和表4。

表4 模型的可信度分析

运用软件进行回归拟合度分析，得到回归方程：

从上述响应面二次模型的方差分析结果可得，此次模型P值大于F值（＜0.05），由此可见本次构建的模型是可信的；模型中P值小于0.05，说明此次三因素三水平的建模分析是可行的。从模型的可信度分析中可以看出，拟合度的值为0.9937，说明海参肠水解度变化有99.37%的可能是由于料液比、pH、水解温度3个自变量改变所导致的。这说明料液比、pH与水解温度直接影响海参水解度，得到的回归方程是有效的，可以用来确定最优的酶解工艺；本次实验的信噪比为34.171，远大于建模所需的信噪比4，说明本次实验建模成功可靠。由表3中F值可以看出，pH对于海参水解度影响最大，料液比其次，酶解温度最小。

2.3 各响应因子水平相互作用的分析

综合料液比、pH和水解温度三因素交互作用对水解度的影响，进行响应面试验优化，结果见图4、图5、图6。

图4 水解温度和料液比对海参肠水解度的交互影响

由图4可知，当水解温度一定时，随着料液比的提高，海参肠水解度缓慢增大然后快速下降；当料液比一定时，海参肠水解度随着水解温度的增大缓慢增大然后有下降的趋势。

图5 水解温度和pH值对海参肠水解度的交互影响

由图5可知，水解温度不变时，随着pH值的增大，酶解海参水解度缓慢增大；当pH值不变时，酶解海参肠水解度随着水解温度的升高，先逐渐地增大而后出现缓慢下降趋势。

图6 pH值和料液比对海参肠水解度的影响

由图6可知，pH值不变时，随着料液比的增大，海参肠水解度缓慢增大而后呈现下降趋势；当料液比不变时，海参肠水解度随着pH值的增大，呈现出上升趋势。

图4、图5、图6表明，海参肠水解度与料液比、pH值和水解温度三个因素有关，且存在最佳参数组合使得胶原蛋白的提取率达到理论最大值。通过软件进行解方程组，得到海参肠的最佳工艺：料液比1∶4.43、pH值7.0、水解温度62.61 ℃，海参肠水解度为56.46%。考虑到实际应用的方便性，将工艺条件取为：料液比1∶4.4、pH值7.0、水解温度63 ℃。

2.4 最优条件的验证

根据优化后的最佳工艺条件，即料液比1∶4.4、pH 7.0、水解温度63 ℃，进行3次水解试验，结果如表5所示，实际值与预测值相差不大，说明模型与实际情况吻合良好。

表5 验证实验结果

3 结论

本文以海参肠为原材料研究其酶解最佳工艺，在单因素试验的基础上，采用响应面法建立了海参酶解工艺的二次多项式数学模型，分析了料液比、pH值和水解温度三因素交互作用对酶解海参肠水解度的影响，得到最佳工艺条件为料液比1∶4.4、pH 7.0、水解温度63 ℃。根据该工艺条件进行3次平行试验验证，得到实际水解度平均值为(55.26±0.71)%，证实模型与实际情况吻合良好。

李冬燕等[12]采用双酶复合进行海参肠酶解，同时考虑料液比、加酶量和水解时间，在最优条件下水解度最大可达 55.76 %，而采用分阶段加酶工艺，水解度高达88.08%[13]，说明水解度还能进一步提高，应考虑更多因素开展进一步试验。酶解工艺可最大限度保留海参肠的营养成分，提高产品质量，具有能耗低和污染少的优点，但在实际生产中，酶的选择应考虑水解率、操作难易、成本等因素。海参肠蛋白质含量为52.27%，粗脂肪含量为15.98%[14]，开发海参肠相关产品的研究报道不多，因此充分开发利用海参肠很有必要，既能避免环境污染又能提高经济效益。