李红梅，李俊起，尹弢，张素文，李尚宾，郈秀菊

（山东省药学科学院，山东省医用高分子材料重点实验室，济南250101）

1 引 言

突发事件造成的意外伤害中，大出血导致的死亡一直是临床上面临的问题。当伤者的血量损失达20%，约800 mL时就有可能出现休克，甚至会危及生命。如何解决大出血的问题，已经越来越引起人们的重视[1]。

止血材料[2-9]一直是国内外研究的热点，目前开发的止血产品，在临床手术中应用广泛，对伤口局部出血、少量出血的止血有很好的效果。临床上常用的止血材料有氧化再生纤维素类、纤维蛋白胶类、壳聚糖类、胶原蛋白类等。材料来源不同，止血机理各不相同，可适用于不同创面的止血。而透明质酸钠类的止血产品鲜见有开发。

本研究制备了透明质酸钠淀粉压缩止血海绵，具有快速吸液和止血性能。透明质酸钠通过交联增加了海绵的机械性能；而淀粉[10-11]的加入降低成本，增加了伤口的粘附性并提高了降解速度。本研究对透明质酸钠与碳化二亚胺[12-14]的交联工艺以及交联后的凝胶与淀粉的复配进行了研究，制备出了具有快速吸液和止血性能的透明质酸钠淀粉压缩止血海绵，并对其形貌、止血性能以及体内降解进行了研究。

2 材料和方法

2.1 材料

透明质酸钠（HA），医用级，华熙福瑞达生物医药有限公司；碳化二亚胺（EDC），上海共价化学科技有限公司；羧甲基淀粉钠（CMS），医用级，华唯纤维素有限公司。

2.2 仪器设备

冷冻干燥机，FD-1A-50型，北京博医康实验仪器有限公司；真空压膜机，FM1202型，北京富友科技有限责任公司；万能材料试验机，AGS-H 5kN，日本岛津公司；热重分析仪，TG209F3型，德国netzsch公司；扫描电子显微镜，SUPRA 55型，德国蔡司Zeiss。

2.3 实验方法

（1）称取一定量的透明质酸钠加入适量水中，磁力搅拌溶解；然后加入适量交联剂，搅拌10 h，用蒸馏水洗涤，过滤，得到块状交联凝胶，以3 000 r/min搅拌交联凝胶30 min，得到均匀的交联透明质酸钠凝胶颗粒。

（2）称取一定量的羧甲基淀粉钠加入适量水中，磁力搅拌溶解，将（1）中的凝胶颗粒加入，搅拌均匀。然后低温冷冻干燥，8 MPa的压力下制得透明质酸钠淀粉压缩止血海绵。用铝箔包装密封后，Co60照射灭菌。

2.4 吸水倍率测试

称取压缩海绵0.8 g[15]，置于洁净干燥的培养皿中，称重m1，加入适量去离子水，待海绵吸水饱和后，倒出多余水分，称重m2，根据式（1）计算吸水率A。

2.5 吸水速率测试

称取压缩止血海绵0.2g，加入水，开始计时，直至样品完全吸水，记录时间（s），吸水速率在20～40 s。

2.6 拉伸强度测试

将压缩止血海绵裁成50 mm×12.5 mm，采用材料试验机进行拉伸强度测定，材料试验机的移动速度为（50±5）mm/min，夹持间距为20 mm。记录最大载荷kgf。

2.7 热重分析

升温范围30～800℃，升温速率10℃/min，氮气流速20 mL/min，氧化铝坩埚。

2.8 SEM测试

取压缩止血海绵，表面真空镀金后进行扫描电镜测试，观察表面形貌。

2.9 动物有效性测试

取健康家兔64只，体重在2.5～3 kg，按照性别、体重随机分组，每组8只，雌雄各半，分别为模型对照组（组号7）、阳性对照品组（组号8）和样品组。家兔用1%戊巴比妥钠30 mg/kg耳缘静脉注射麻醉后耳部脱毛，轻弹几下。距耳尖部8 cm处割断耳动脉，3 s后擦拭创面，将相应受试物覆盖创面，并且开始计时，轻压压缩止血海绵，让其吸附在创面上。每隔30 s观察伤口的流血情况，用滤纸条轻轻蘸吸直至血液不再渗出，记录所需时间即为有效止血时间。模型对照组使用医用纱布止血，阳性对照品组使用大清生物纸。在试验过程中，观察压缩止血海绵在不用外力按压的情况下能否与伤口贴合，以考察样品与组织的粘附性。

2.10 动物降解试验

将60只SD大鼠分为6组，每组10只，雌雄各半[13]，由山东省药学科学院新药评价中心提供，用1%戊巴比妥钠（雌性35 mg/kg、雄性40 mg/kg）将60只SD大鼠腹腔注射麻醉后，在每只动物肝脏相同部位分别取横切面约5 mm×5 mm、深约3 mm的出血创面，有血珠渗出后擦拭创面，将压缩止血海绵覆盖于相应创面，完全止血后缝合腹壁，放回笼中继续饲养。所有动物均给予青霉素钠3 d。3周剖解动物，肉眼观察降解情况。并且分别切取植入部位组织标本，包括植入物及其周围足够多的未受影响的组织。光学显微镜下进行组织学评价。

3 结果与讨论

3.1 交联工艺筛选

分别按照 HA：EDC=1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1的比例进行交联试验，-55℃冻干24 h，压制、辐照灭菌，然后测试其吸水倍率和拉伸强度。其结果见表1，HA：EDC的最佳比例为2∶1。

表1 交联透明质酸的性能测试Table 1 Performance test of cross-linked hyaluronic acid

3.2 配方工艺筛选

分别配制质量浓度为2%、4%、6%、8%的羧甲基淀粉钠水溶液，取HA：EDC=2∶1的透明质酸钠凝胶，和淀粉质量比分别为 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，测试其拉伸强度、吸水倍率和吸水速率，见表2，最佳配方：羧甲基淀粉钠质量浓度为6%，和透明质酸钠凝胶的比例为1∶3。

表2 压缩止血海绵的拉伸强度和吸水倍率Table 2 Stretching strength and absorbent rate of compressed hemostatic sponge

3.3 TGA的测试

分别将透明质酸钠和压缩止血海绵的样品作TGA分析，结果见图1。

图1 透明质酸钠和压缩止血海绵的TGA图Fig 1 The TGA of HA and compressed hemostatic Sponge

透明质酸钠的分解温度为236.8℃，压缩止血海绵的分解温度为284.4℃。说明压缩止血海绵已经交联，分解温度越高，热稳定性越好，又具有空间网络结构，更满足临床使用要求。

3.4 SEM测试

压缩止血海绵的扫描电镜图（放大100倍和放大200倍），见图2。

图2 透明质酸钠淀粉压缩止血海绵的扫描电镜图Fig 2 The SEM of Sodium hyaluronate-starch compressed hemostatic sponge

由图2可知，本实验制备的透明质酸钠淀粉压缩止血海绵形成了网络结构，为透明质酸钠淀粉压缩止血海绵快速吸液提供了基础。

3.5 动物有效性试验

表3 各组动物有效性试验Table 3 Hemostatic time of groups

由表3的数据可知，本研究得到的压缩止血海绵止血时间短，出血量少。

在实验过程中，阳性对照品组（组号8）和样品组与伤口的贴合程度较好，与组织的粘附性好，不需要较大的外力即可贴合。

3.6 动物降解试验

主要仪器设备：电子称，秒表，游标卡尺，滤纸，脱脂棉，手术器械等。

在植入期内每周定点观察每只动物，均无任何异常现象。3周时剖解动物，肉眼观察材料不可见。组织病理学结果：3周植入部位肌肉包膜全部完好。HE染色结果：3周时切除的肝组织处肝组织结构正常，未观察到样品残留，3周的组织切片见图3。

图3 3周时的病理切片（10×；100μm）Fig 3 Pathological section of 3 weeks（10×；100μm）

4 结论

本研究对透明质酸钠的交联工艺以及透明质酸钠淀粉配方工艺进行了摸索，HA：EDC的比例为2∶1，羧甲基淀粉钠质量浓度为6%，和交联透明质酸钠凝胶的比例为1∶3时性能最佳。制备出的透明质酸钠淀粉压缩止血海绵热重分析表明，压缩止血海绵已经交联，热稳定性好、机械性能高；止血试验以及体内降解试验结果表明，本研究的压缩止血海绵产品具有快速吸液和良好的止血性能，吸液量大，止血性能良好，降解时间能够满足临床上对于止血海绵的性能要求。具有很好的临床应用前景。