金晓雲，赵鑫，苏艳丽，刘伊骐，冯致*，毛娟*（甘肃农业大学园艺学院，甘肃兰州 730070）

葡萄为多年生藤本浆果类果，有着悠久的种植历史。‘黑比诺’作为重要的酒用品种，其果实产量和品质直接影响到葡萄酒的产量和品质。而植物组织培养技术作为一种方便快捷的培养技术，现已应用于药用植物[1]、花卉[2]、果树[3]、草业[4]和农业生产[5]等多个领域中并日趋发展成熟。在试管苗组织培养当中，外源糖可以作为碳源来维持植株正常生长发育，CO2的浓度也会影响到试管苗的生长发育。故研究外源糖以及高CO2浓度对葡萄试管苗的影响对进一步研究试管苗糖代谢以及CO2对试管苗生长的影响有着重要的意义。

外界条件能够影响葡萄试管苗的生长。研究发现，外源糖种类的不同会影响试管苗相关酶活性的表达，糖代谢相关酶活性在试管苗生长发育过程中表现出差异显著性，并且ZT、IAA、ABA含量在不同糖处理间均表现出一定的差异显著性[6-9]，糖信号的转导也参与了植物根离子转运系统的调控[10]。糖还会诱导激素的产生，影响激素的生物合成[11]。糖也在植物生长发育、代谢调控及抵抗胁迫等方面具有重要调节作用，糖作为信号分子参与调控低温胁迫[12]。而CO2浓度的升高可以增加红桦可溶性蛋白的总量，改变可溶性蛋白的分配模式[13]。高浓度CO2条件下的香蕉叶片光合速率明显高于低浓度CO2条件下的叶片光合速率[14]。另外，CO2浓度的升高有可能影响到了光合作用以及氮同化相关基因的转录[15]。培养基糖种类及CO2浓度的变化与植株的生长发育、激素调节、离子转运、可溶性蛋白含量等相关。

外源糖与CO2浓度在植物生长各环节中发挥着重要作用，但高CO2浓度下不同糖种类对葡萄试管苗如何影响试管苗的生长发育、叶绿素荧光参数、可溶性蛋白质含量方面影响的相关研究鲜见报道。因此，本文以‘黑比诺’葡萄试管苗为材料，研究相关数据，进而分析高CO2浓度下外源糖种类的不同对葡萄试管苗生长发育及光合能力的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验设计

试验所用材料‘黑比诺’（Pinot Noir）试管苗来自甘肃农业大学园艺学院试验室。以GS为基本培养基，分别加入蔗糖、葡萄糖、果糖各20 g/L作为3个糖源处理；正常CO2环境浓度（380±40）μmol/mol，3个糖源处理分别命名为S、G、F；高CO2环境（1000 μmol/mol）3个糖源处理分别命名为S1、G1、F1。转接‘黑比诺’试管苗单芽茎段，转接后放入PQX-430D人工气候箱27 ℃、16 h光照/8 h黑暗进行培养，光照强度120 μmol/(m2·s)。高CO2处理PQX-430D人工气候箱加装CO2控制模块。每7 d观察一次，待生根后每3 d观察一次。转接第25天后测定试管苗叶片叶绿素荧光参数、可溶性蛋白含量以及叶绿素相对含量。

1.2 测定方法

可溶性蛋白质测定：采用考马斯亮蓝G-250染色法测定‘黑比诺’样品中可溶性蛋白含量。

叶绿素相对含量测定：叶绿素含量采用SPAD-502叶绿素仪测定。利用SPAD-502叶绿素仪测定叶片的前中后3个不同的位置，计算其平均值，进行3次重复。

叶绿素荧光：将‘黑比诺’幼苗暗适应30 min，对充分展开的第3、4片功能叶利用调制叶绿素荧光成像系统（MAXI Imaging-PAM, Walz, Effeltrich, Germany）进行叶绿素荧光参数测定。1.3 数据处理

采用Excel 2010软件进行试验数据录入以及数据图表的制作。采用SPSS进行数据整理与统计分析。

2 结果与分析

2.1 高CO2浓度下不同糖种类对试管苗愈伤组织的影响

如图1，正常条件G处理在转接9 d后大量出现愈伤组织，18 d后出愈率达98%。转接9 d后S处理试管苗70%出现愈伤组织，转接21 d时，出愈率达95%。转接9 d时F处理出愈率仅为51%，转接后9～15 d，大量产生愈伤组织，第21天后愈伤组织诱导率为95%。高CO2条件下转接试管苗9 d后，G1处理试管苗出愈率达85%，在第21天后全部处理出现愈伤组织。S1转接第9天时，78%出现愈伤组织，在转接后12～18 d愈伤组织生长迅速，18 d后趋于平稳。F1在9 d后出愈率为64%，9～15 d后愈伤组织生长大幅增长，18 d后生长速度趋于平稳。总体表现为：相同环境下，蔗糖处理对植株愈伤组织生长前期的促进作用最为显著。同种糖处理下，高CO2浓度在试管苗转接后能够促进愈伤组织的生长，但在生长后期与正常CO2浓度处理愈伤组织生长趋于一致。

图1 不同外源糖及CO2浓度处理对试管苗愈伤组织的影响Figure 1 Changes of different sugars and different concentration of CO2 on callus in vitro

2.2 高CO2浓度下不同糖类对试管苗生根的影响

高CO2环境下葡萄糖处理平均根长增加最为显著，较其他两种处理平均根长分别增长0.54 cm、1.02 cm。高CO2环境下G、S与F三个处理试管苗前30 d根长高于正常CO2浓度。正常处理平均根长为3.4 cm，高CO2处理平均根长为2.7cm。但在生长后期，高CO2浓度处理植株生长速度减缓，6个处理根长并无显著差异（图2）。

图2 不同外源糖及CO2浓度处理下试管苗根长的变化Figure 2 Changes of different sugars and different concentration of carbon dioxide on root length in vitro

2.3 高CO2浓度下不同糖种类对试管苗株高的影响

高CO2浓度下18～24 d株高平均生长速度加快，平均值较正常处理分别增加2.33 cm、1.20 cm、1.00 cm。外源增施葡萄糖对植株生长促进作用明显（图3）。

图3 不同外源糖处理及CO2浓度对试管苗株高的影响Figure 3 Effects of different sugars and different concentration of carbon dioxide on plant height in vitro

2.4 高CO2浓度下不同外源糖种类对试管苗可溶性蛋白质及叶绿素含量的影响

高CO2浓度处理下，G1与S1处理试管苗叶片可溶性蛋白质含量显著高于F1处理，G1与S1可溶性蛋白含量无显著性差异（图4-A）。正常CO2浓度下F叶绿素含量分别高出其他两种处理6.09、4.63。3种处理叶绿素相对含量由低到高依次为G、S、F。G1与S1叶绿素含量几乎一致，由此可以看出，不同糖类处理的植株对CO2浓度反应不同。果糖处理植株叶片的叶绿素相对含量对CO2浓度的变化反应更为明显。高CO2浓度对果糖处理植株叶绿素合成表现出抑制作用，从而使得叶绿素相对含量下降（图4-B）。

图4 不同外源糖及CO2浓度处理下试管苗叶片可溶性蛋白质含量和叶绿素含量Figure 4 Soluble protein content and chlorophyll content of different sugars and different concentration of CO2 in vitro

2.5 高CO2浓度下不同外源糖种类对试管苗叶绿素荧光参数的影响

高CO2浓度下，G1处理试管苗叶片电子传递速率大于其他两处理（图5-A）。正常条件不同糖处理试管苗叶片实际光量子产量（ΦPSII）从高到低依次为：G＞S＞F。高CO2下，蔗糖与果糖处理试管苗叶片ΦPSII均高于正常处理，而葡萄糖处理下叶片ΦPSII相比正常处理下降（图5-B）。正常CO2条件下非光化学淬灭系数（NPQ）三种糖处理无显著差异。高CO2三种糖处理NPQ显著低于正常CO2处理，其中G1处理显著低于其他处理（图5-C）。叶片最大量子产量（Fv/Fm）在正常CO2处理下无显著差异。在高浓度CO2的三种糖处理的Fv/Fm均高于正常CO2处理，其中S1与F1相比G1处理显著升高（图5-D）。

图5 不同外源糖处理及CO2浓度对试管苗叶绿素荧光相关参数的变化Figure 5 Changes of chlorophyll fluorescence parameters of different sugars and different concentration of CO2 in vitro

3 讨论与结论

植物组织培养中主要以蔗糖作为碳源。但不同植物对不同糖类的反应不完全相同[16]。蔗糖被植物吸收后被分解为己糖，蔗糖通过蔗糖合成酶（SS）催化生成果糖，经转化酶（IVR）水解生成果糖与葡萄糖[17]；而酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）将会催化蔗糖不可逆分解为果糖和葡萄糖[18]。本试验发现：在高浓度CO2下，葡萄糖对单芽茎段愈伤组织的形成有明显促进作用，而果糖对试管苗愈伤组织的形成促进作用较弱。

葡萄糖作为信号分子，通过糖酵解和线粒体磷酸化来调控叶片光合作用，促进根分生组织活性[19]。葡萄糖对试管苗根的生长有明显的促进作用，这与前人的研究相一致，并且外源葡萄糖可以增加植株侧根以及根毛数量[19-20]。葡萄糖可以通过糖酵解和线粒体生物能传递，驱动TOR信号传导，从而快速控制根分生组织代谢转录网络，活化细胞周期，进而促进根分生组织激活[21]。高CO2浓度下不同糖源对植株根系生长速度的影响表现出显著差异。

本试验结果进一步表明高浓度CO2还引起了不同糖源影响植株的实际光量子产量差异性表达。试验还发现，在植株生长初期高CO2浓度处理促进试管苗生长，其长势明显优于正常处理植株，而在生长后期，CO2处理不再表现出明显优势。这可能是高CO2浓度负反馈调节呼吸代谢有关[22]，或者是因为植株对高CO2浓度环境产生了光和适应。而本试验未涉及高CO2浓度对酸性转化酶等相关酶对蔗糖分解速率的研究，这有待进一步探索。

叶片中可溶性蛋白含量的高低可以反映不同处理植株的氮素代谢水平。叶片中所含的可溶性蛋白主要包括以RuBp羧化酶为主的可溶性蛋白，参与卡尔文循环的相关酶，以及位于叶绿体类囊体膜上含有色素蛋白复合体的相关蛋白[13]。试验发现在高CO2浓度环境中，蔗糖处理可溶性蛋白含量最高，这可能是由于CO2浓度的增加影响到了蔗糖的不可逆分解进程。

试验通过统计第25天试管苗叶片叶绿素相对含量发现，果糖处理中叶绿素相对含量较高，说明果糖对植株叶片叶绿素的合成起到明显促进作用。这说明外界CO2浓度影响到了不同糖在试管苗体内的代谢进程。

Fv/Fm可以反映PSII反应中心潜在光能转化效率，即PSII反应中心均处于开放状态时的量子产量。ΦPSII即线性电子传递的量子效率，也是PSII实际的电子传递的量子效率，其值用来反映电子在PSII与PSI的传递情况[23]。当PSII反应中心天线色素吸收了过量的光能时，如不能及时地耗散将对光合机构造成失活或破坏，所以非光化学淬灭是一种自我保护机制，对光合机构起一定的保护作用[24]。正常CO2条件三种糖处理NPQ应高于高CO2处理，说明高CO2能够促进PSII反应中心吸收光能，降低过剩光能对光系统的破坏。根据彭长连等[25]的研究，高CO2浓度能够提高PSII光化学活性，并且促进PSII电子传递的相对量子产量。增加叶绿素荧光光化学淬灭组分，降低非光化学猝灭组分。试验发现在高CO2浓度下，葡萄糖处理电子传递量子效率实际光化学产量均低于其他两种处理并表现出显著差异。而其非光化学淬灭系数也低于其他两种处理。说明葡萄糖处理对所吸收的过量光能的耗散能力较差，导致其光合机制被破坏，从而造成了其光化学效率降低。

根据试验结果，葡萄糖对单芽茎段愈伤组织的形成有明显促进作用，而果糖对试管苗愈伤组织的形成促进作用较弱。同时表明，葡萄糖对试管苗根的生长有明显的促进作用。糖种类的不同还影响了植物体内不同糖的转化速率以及相关糖转化酶的活性。

不同CO2浓度对植株根系的生长速度表现出显著差异。高CO2浓度可以刺激植株快速生长，并直接影响到植物光合作用效果。而本试验中未涉及CO2浓度和不同糖浓度互相作用如何能够构成试管苗的最适生长环境，这有待进一步探索。