集贤，张平*，朱志强，李志文，商佳胤，魏雅纯

（1. 国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津）/天津市林业果树研究所/农业农村部农产品贮藏保鲜重点实验室，天津 300384；2. 天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384；3. 天津市设施农业研究所，天津 301700）

葡萄品种按用途可分为鲜食、酿酒、制干、制汁等加工品种，中国是世界上葡萄较早栽培地之一。目前，中国栽培较多的鲜食品种有：‘巨峰’‘红地球’‘玫瑰香’‘无核白’‘夏黑’等。葡萄不仅味美可口，而且营养价值很高。葡萄中的多种果酸有助于消化，适当多吃些葡萄，能健脾和胃。

近些年，随着市场经济的逐渐加快，对于葡萄的需求量也越来越大，市场供应期相应延长，因此对鲜食葡萄的贮藏保鲜技术提出了更高的要求。葡萄灰霉病，病原菌为灰葡萄孢，寄生范围广泛，腐生能力强，是目前葡萄采后贮藏运输过程中主要病害之一。因为该菌在低温条件（-0.5 ℃）仍能生长繁殖，因此充分了解不同品种采后对灰霉病的抗病性以及对果实的侵染规律，可以有效地控制采后病害的发生，为葡萄采后贮运保鲜提供理论基础。

在葡萄采后运输贮藏过程中，环境因子对生物的生长影响较大[1-2]，温度是影响果品质量最重要的因素之一，能够直接影响果蔬的生理活性。温控技术应用广泛且历时已久，早期的窖藏、现代的冷库贮藏等都是采用控制贮藏温度的方法来延长果蔬贮藏期的。而随着科学技术飞速发展，贮藏保鲜技术也在不断更新，如今温控技术在果蔬贮藏调控方面的应用已非常成熟。近年来，关于温度的贮藏技术包括低温贮藏技术[3]、变温贮藏技术[4]及冰温贮藏技术[5]已广泛用于果蔬贮运活动中。

本试验采用有伤接种和无伤接种两种方式，系统研究不同贮藏温度对3个葡萄品种接种菌落直径和发病率的影响，充分了解温度对不同品种葡萄果实采后灰霉病的发病规律，了解不同葡萄品种对采后灰霉病的抗病性差异，为有效指导采后贮藏生产实践和保鲜技术理论充分发挥实际作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试葡萄：葡萄品种选择‘玫瑰香’‘巨峰’和‘红地球’，2015年9月分别购于天津市汉沽茶淀镇、河北石家庄晋州市葡萄园、河北张家口市。

仪器：高压灭菌锅、紫外-可见分光光度计、高速冷冻离心机、恒温培养箱、水浴锅、塑料密封盒等。

1.2 试验方法

1.2.1 灰霉菌的分离和提纯

参照方中达[6]法，将发病葡萄表面菌丝在超净工作台上接入到PDA培养基中，放入恒温培养箱不断分离纯化培养，直至在显微镜下观察到提纯的灰霉菌。

1.2.2 不同温度下灰霉病菌对葡萄果实致病性的影响

（1）有伤接种。在超净工作台中，将分离纯化后的灰霉菌PDA平板用烧热的打孔器打满3 mm的菌饼备用。选取大小整齐、无损伤的带柄葡萄果粒，将实心杆烧热刺伤果粒（直径3 mm，深度5 mm），灭菌滤纸吸干溢出果汁，并接入直径3 mm的菌饼。每果粒接种一个菌碟，每种温度接种处理20粒左右（以占满密封盒为准），放入垫有无菌纱布的灭菌密封盒中。设置3个重复，于0 ℃、10 ℃、25 ℃下贮藏。从第2天开始，每天观察发病情况，用游标卡尺测量菌饼直径并记录，连续观察7 d。

（2）无伤接种。在超净工作台中，将分离纯化后的灰霉菌PDA培养基用烧热的打孔器打10个10 mm的菌饼，放入灭菌的锥形瓶中，加入200 mL无菌水，震荡1 h制成孢子悬浮液。选取大小整齐、无损伤的带柄葡萄果粒浸入孢子悬浮液中，取出后自然晾干。每种温度接种处理20粒左右（以占满密封盒为准），放入垫有无菌纱布的灭菌密封盒中。设置3个重复，于0 ℃、10 ℃、25 ℃下贮藏。从第2天开始，每天观察发病情况，记录连续拍照观察7 d。隔几天用液氮冻样一次，共3次。葡萄果粒出现凹陷、长出灰霉菌计为发病果粒。计算发病葡萄果粒所占每盒总个数的百分数含量，即发病率。

2 结果与分析

2.1 不同贮温对有伤接种果实病斑直径的影响

由图1所示，从菌落生长趋势来看，3个品种有伤接种变化趋势类似，10 ℃和25 ℃贮藏条件下，随着贮藏期的延长，果实上菌落直径均呈现增加的趋势；而0 ℃贮藏条件下，菌落的生长完全受到抑制。从菌落直径的比较来看，0 ℃贮藏条件下，培养至7 d，由于菌落生长完全受到低温的抑制，菌落直径生长量为0，极显著（P＜0.01）低于其余两个温度处理；10 ℃贮藏条件下，菌落直径均极显著（P＜0.01）小于25 ℃温度处理。

图1的分析结果可以明显得出，随着贮藏温度的降低，有伤接种于各个品种果实上的灰霉菌生长均会受到不同程度的抑制，当贮藏温度降至0 ℃时，7 d内3个品种果实上接种的灰霉菌均停止生长。从不同品种灰霉菌对温度变化的耐受性来看，当贮温从25 ℃降至10 ℃，‘玫瑰香’接种的灰霉菌菌落直径变化相对较小，因此其上接种灰霉菌对温度变化的耐受性更强，说明‘玫瑰香’葡萄品种更易感病。

图1 不同贮温对有伤接种果实病斑直径的影响Table 1 The effect of disease spot diameter of damage inoculation on fruit in different storage temperature

2.2 不同贮温对无伤接种果实灰霉病发病率的影响

由图2所示，从菌落生长趋势来看，随着贮藏期的延长，25 ℃贮藏条件下的发病率总体上呈先骤然增加后缓慢增加的趋势；10 ℃贮藏条件下，发病率除‘玫瑰香’葡萄与25 ℃的发病率相差不大外，总体呈逐渐增加的趋势；而0 ℃贮藏条件下，菌落的生长完全受到抑制。从发病率上来看，0 ℃贮藏条件下，培养至7 d，其发病率为0，极显著（P＜0.01）低于其余两个温度处理；10 ℃贮藏条件下，‘玫瑰香’在培养1～3 d时菌落直径接近25 ℃处理，在其余的贮藏时间内，菌落直径均小于25 ℃温度处理；‘巨峰’仅在培养第1天、第2天和第6天时菌落直径接近于25 ℃处理，而‘红地球’在第4天时菌落直径接近于25 ℃处理，在其余的贮藏时间内，菌落直径均显著（P＜0.05）小于10 ℃处理。

图2 不同贮温对无伤接种果实灰霉病发病率的影响Table 2 The effect of Botrytis cinerea incidence by non-damage inoculation in different storage temperature on fruit

图2的分析结果得出，随着贮藏温度的降低，无伤接种的‘玫瑰香’‘红地球’果实上的灰霉菌生长均受到不同程度的抑制。‘玫瑰香’和‘巨峰’在25 ℃下发病率低于‘红地球’，但‘红地球’葡萄在10 ℃下发病率最低。当贮藏温度降至0 ℃时，7 d内3个品种葡萄果实上接种的灰霉菌均停止生长。

2.3 不同贮温对自然发病条件下葡萄灰霉病发病率的影响

自然状态下，不同贮温对采后灰霉病发病率的影响如图3所示。从生长趋势来看，随着贮藏期的延长，25 ℃贮藏条件下，灰霉病发病率总体上呈增加的趋势，而‘玫瑰香’葡萄发病率增加的最快，‘红地球’葡萄增加的最慢；10 ℃贮藏条件下，发病率总体呈逐渐增加的趋势，但‘玫瑰香’后期增加迅速；而0 ℃贮藏条件下，菌落的生长完全受到抑制。从发病率上来看，0 ℃贮藏条件下，培养至7 d，由于菌落生长完全受到低温的抑制，其发病率几乎为0，极显著（P＜0.01）低于其余两个温度处理；10 ℃贮藏条件下，发病率均显著（P＜0.05）小于25 ℃温度处理。

图3的分析结果可以得出，随着贮藏温度的降低，无伤接种于‘玫瑰香’‘巨峰’‘红地球’果实上的灰霉菌生长均会受到不同程度的抑制。模拟自然状态下生长的灰霉菌，25 ℃时‘玫瑰香’的发病率最高，‘巨峰’在25 ℃和10 ℃下发病率相近，第5天后增长缓慢。在0 ℃下，3个葡萄品种发病率均为零。

图3 不同贮温对自然条件下葡萄灰霉病发病率的影响Table 3 Effects of Botrytis cinerea incidence on under natural conditions in different storage temperatures

3 讨论与结论

有伤接种模拟在运输过程中有挤压裂果的情况下灰霉病菌对果实的侵染状况。结果表明，有伤接种灰霉病菌显著增长，无伤接种灰霉菌的增长高于自然状态下发病率。在运输中，应采取低温贮藏的方法，并且做好防止裂果的工作，可以在一定程度上抑制灰霉菌的生长。

贮藏温度是影响灰霉菌生长繁殖的重要因子之一[7]，本试验研究得出以下结论：‘玫瑰香’‘巨峰’‘红地球’葡萄在0 ℃的两种接种方法下，观察期内并未发病，而在10 ℃和25 ℃下灰霉菌有明显的生长繁殖现象，菌斑直径显著增大。可见低温有效抑制灰霉病的发生与生长。本研究结果也印证了葡萄最适贮藏温度普遍认为是0～-1 ℃[8-10]的结论，同时也与前期本课题组低温能够很好地抑制灰霉病菌孢子的研究相呼应[11]。低温条件下灰霉病对果实的侵染率低，与低温可以降低果实的呼吸速率和抑制酚类物质的增加有关[12]，同时也与低温条件能显著减少葡萄果肉和果皮抗氧化组分含量的下降，可以维持果实较高的自由基清除能力有关[13]。