朱明新 沈敢锋 滕云

(浙江海正药业股份有限公司，台州 318000)

5-酮基米尔贝霉素是由米尔贝霉素制备米尔贝肟的中间体。米尔贝霉素(milbemycins)是由链霉菌产生的十六元环大环内酯类驱虫药物，由日本三共株式会社于1967年发现[1]，经过近20年的改良于1986年以米尔贝肟(milbemycin oxime)上市，为当时唯一单一成分可以同时防治犬恶丝虫及肠道寄生虫的产品[2]。

米尔贝肟在中国、欧洲、日本、美国被广泛用于控制和预防动物体内外大部分常见寄生虫，具有很好的效果[3-5]。由于米尔贝肟杀虫活性高、毒性小，LD50是临床推荐用量的2000倍以上，同时对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，所以具有很好的市场前景[6]。

目前，米尔贝肟较为普遍是通过发酵半合成生产的[7-9]，主要步骤包括链霉菌发酵产米尔贝霉素A3/A4，米尔贝霉素A3/A4经过氧化反应生成5-酮基米尔贝霉素A3/A4，再经过肟化反应生成米尔贝肟A3/A4。由米尔贝霉素氧化生成5-酮基米尔贝霉素这一步骤存在氧化收率低，氧化剂价格昂贵，氧化所用催化剂易产生恶臭、环保压力大的问题。

目前，海正药业项目团队已经开发了由基因改造链霉菌发酵直接产5-酮基米尔贝霉素[6]，经提取纯化后得到5-酮基米尔贝霉素晶体[10]，再经一步肟化反应生成米尔贝肟。该工艺简化了合成路线，提高了收率，避免了氧化步骤带来的环境污染。由于工艺路线变化较大，也会使得米尔贝肟的杂质发生改变，所以有必要对中间体5-酮基米尔贝霉素的杂质谱进行系统性研究，满足药监部门对杂质研究日益提高的要求。

按照来源，原料药中杂质可以分为工艺杂质(包括合成中未反应完全的反应物及试剂、中间体、副产物、从反应物及试剂中混入的杂质等)和降解产物(生产、贮藏、运输过程中因原料药不稳定产生的杂质)等[11]。

本研究对5-酮基米尔贝霉素的两个工艺杂质和两个降解杂质进行了样品制备、结构鉴定和初步研究。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

5-酮基米尔贝霉素A3/A4粗品以及A3、A4单组分样品都是由本公司实验室制得的小试样品。硅胶(青岛海洋化工有限公司生产，300～400目)；乙腈(Merck，色谱纯)；DMSO(北京伊诺凯科技有限公司，分析纯)；甲醇及其它试剂(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)。

1.2 仪器

Agilent-1260高效液相色谱仪，Agilent-6540 QTof 质谱仪，Bruker- Avance400核磁共振仪。

1.3 杂质分离制备方法

1.3.1 工艺杂质C、D的制备

5-酮基米尔贝霉素A3/A4粗品按照沈敢锋等[10]专利中的方法制得，将粗品用甲醇溶解，加载至硅胶柱，上柱量约5g/L硅胶，用正庚烷-丙酮(95:5,V/V)洗脱。杂质D、杂质C、5-酮基米尔贝霉素A4、5-酮基米尔贝霉素A3依次被洗出，分段收集。将杂质C、杂质D纯度高的部分分别混合后再浓缩降温结晶，得到高纯度的杂质C和D。A3、A4单组分样品亦是采用上述方法制得。

1.3.2 5-酮基米尔贝霉素A3碱降解杂质及A4碱降解杂质的制备

将5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分样品分别溶于70%甲醇，再用1mol/L的NaOH调节pH至12.5左右，静置4h，经HPLC检测碱降解较完全，再用1mol/L盐酸回调pH至中性。分别加载至硅胶柱，上柱量约5g/L硅胶，用正庚烷-丙酮(95:5,V/V)洗脱，分段收集，将A3碱降解杂质、A4碱降解杂质纯度高的部分分别混合并浓缩干即得到5-酮基米尔贝霉素A3碱降解杂质、5-酮基米尔贝霉素A4碱降解杂质。

1.4 分析方法

1.4.1 高效液相色谱(HPLC)分析条件

色谱柱：Aglient C18或C8反相柱(4.6mm×150mm,3.5μm)；流动相：A相：0.01mol/L乙酸铵，B相：乙腈，梯度洗脱：0～60min，B相从70%升高至80%；波长：240nm；流速：1mL/min；进样量：10μL。该方法是基于黄隽等[12]论文中的分析方法进行的优化。

1.4.2 质谱分析条件

离子源：电喷雾电离源(ESI)；离子极性：正离子；雾化器温度：325℃；雾化器干气流速：8L/min；喷雾器压力：35psig；喷雾电压：+3500V。取适量样品于进样瓶中，用50%乙腈水溶液溶解、摇匀，作为样品检测溶液进行质谱分析。

1.4.3 液质联用分析条件

将“1.4.1”项的液相分析条件和“1.4.2”项的质谱分析条件联用，对样品进行液质联用分析。

1.4.4 核磁共振波谱分析条件

溶剂：丙酮，内标物：TMS。取适量样品加入核磁管内，加入约0.5mL DMSO试剂，振荡使样品充分溶解，作为样品溶液，分别进行核磁共振氢谱(1H NMR)、碳谱(13C NMR，DEPT135°)以及相关谱(1H-1H COSY、HSQC和HMBC)分析。

2 结果与讨论

2.1 HPLC法分析5-酮基米尔贝霉素A3/A4粗品主要杂质

采用HPLC法跟踪5-酮基米尔贝霉素提取工艺各步骤料液组分的变化，发现粗品中杂质C、D为两个最主要的工艺杂质，是菌体代谢过程产生的。杂质C、D在发酵液及粗品HPLC图谱中的位置如图1～2所示。

2.2 强制降解实验

图1 5-酮基米尔贝霉素发酵液的典型HPLC图谱Fig.1 The typical HPLC chromatogram of 5-keto milbemycinA3/A4 fermentation broth

图2 5-酮基米尔贝霉素A3/A4粗品的典型HPLC图谱Fig.2 The typical HPLC chromatogram of 5-keto milbemycinA3/A4 crude product

将5-酮基米尔贝霉素A3/A4粗品进行高温、高湿、光照、氧化、酸碱等降解实验，实验发现：高温、高湿条件下样品较稳定；氧化、光照条件下样品略微降解；碱性条件下粗品中A3、A4组分几乎完全降解，杂质E、F含量显著增加。

加速稳定性实验发现样品稳定性良好，降解缓慢。稳定性数据如表1所示。

2.3 杂质制备

采用“1.3”项方法制备工艺杂质C、D及5-酮基米尔贝霉素A3单组分、A4单组分样品，并根据“1.3.2”项的方法进行碱降解试验，制备5-酮基米尔贝霉素A3碱降解杂质和A4碱降解杂质。图3分别为A3单组分、A4单组分碱降解前后的HPLC对比图谱。图4为制备的4个杂质与粗品的HPLC对比图谱。

从图4可以看出A3、A4单组分碱降解杂质峰出峰时间分别与粗品溶液杂质E、杂质F出峰时间重合，它们可能分别为同一物质。

2.4 杂质结构鉴定

经质谱、核磁共振谱分析，对上述制备的4个杂质进行了结构确证，波普数据和结构解析结果如下。

表1 5-酮基米尔贝霉素A3/A4粗品加速稳定性试验结果Tab.1 The accelerated stability test results of 5-keto milbemycin A3/A4 crude product

图3 5-酮基米尔贝霉素A3/A4单组分碱降解前后HPLC对比图谱Fig.3 The comparison of HPLC chromatogram before and after alkaline degradation of 5-keto milbemycin A3/A4 single component

图4 4个杂质与A3/A4粗品的HPLC对比图谱Fig.4 The comparison of HPLC chromatogram of A3/A4 crude sample with impurities

2.4.1 杂质C

样品质谱图中m/z=549.3187的离子峰为[M+Na]+的峰，表明该杂质的分子量为526.7140，高分辨质谱确定[M+Na]+549.3186峰的元素组成为C32H46NaO6，证明本品的元素组成为C32H46O6。核磁共振碳谱中共有32个碳信号，分别为6个伯碳原子，8个仲碳原子，11个叔碳原子，7个季碳原子。具体归属如下：

1H NMR(acetone-d6,400MHz),δ:6.60(s,1H,H-24),6.17～6.28(m,2H,H-17-18),5.30(dd,J=13.6,9.9Hz,1H,H-16),5.18～5.26(m,1H,H-2),4.94～4.96(m,1H,H-12),4.12(s,1H,H-26-OH),3.95(s,1H,H-25),3.58～3.65(m,1H,H-9),3.12(t,J=9.4Hz,1H,H-5),2.99(d,J=16.1Hz,1H,H-21),2.53(m,1H,H-15),2.17～2.27(m,4H,H-11-14-21),2.00(dd,J=11.4,3.7Hz,1H,H-3),1.85～1.93(m,5H,H-20-10-14),1.78(s,3H,H-32),1.62～1.71(m,5H,H-30-8-27),1.48～1.59(m,3H,H-7-8),1.28～1.37(m,3H,H-3-27-6),1.03(d,J=6.4Hz,3H,H-31),0.96(t,J=7.2Hz,3H,H-28),0.79～0.91(m,4H,H-29-10);13C NMR(acetone-d6,125MHz),δ:197.08(C-22),172.01(C-1),141.22(C-16),139.07(C-24),137.85(C-19),136.98(C-13),136.00(C-23),126.38(C-17),125.59(C-18),121.86(C-12),98.08(C-4),80.51(C-26),76.59(C-5),69.24(C-2),68.58(C-9),49.35(C-14),49.31(C-25),48.86(C-21),42.28(C-3),37.12(C-10-15),36.47(C-8),35.34(C-11),35.21(C-6),28.73(C-7),26.51(C-27),22.40(C-31),18.10(C-29),16.26(C-30),15.78(C-32),14.41(C-20),10.44(C-28)。

2.4.2 杂质D

样品质谱图中m/z=509.3264的离子峰为[M+H]+的峰，表明该杂质的分子量为508.6990，高分辨质谱确定[M+H]+509.3264峰的元素组成为C32H45O5，证明本品的元素组成为C32H44O5。核磁共振碳谱中共有32个碳信号，分别为6个伯碳原子，7个仲碳原子，11个叔碳原子，8个季碳原子。具体归属如下：

1H NMR(acetone-d6,400MHz),δ:8.71(s,1H,H-22-OH),7.33(s,1H,H-24),6.70(s,1H,H-21),6.19(dd,J=14.9,11.0Hz,1H,H-17),5.61(d,J=10.8Hz,1H,H-18),5.39～5.45(m,1H,H-2),5.25(dd,J=15.0,9.6Hz，1H,H-16),4.93(d,J=10.2Hz,1H,H-12),3.67～3.73(m,1H,H-9),3.13(t,J=9.2Hz,1H,H-5),2.47～2.59(m,1H,H-15),2.26～2.29(m,1H,H-11),2.14～2.22(m,5H,H-32-11-14),2.04～2.05(m,3H,H-20),1.96～1.99(m,1H,H-10),1.86～1.93(m,2H,H-3-14),1.69～1.75(m,1H,H-27),1.65(s,3H,H-30),1.58～1.63(m,1H,H-27),1.45～1.55(m,3H,H-7-8),1.27～1.37(m,3H,H-3-27-6),0.98(t,J=7.3Hz,3H,H-28),0.80(d,J=6.6Hz,3H,H-29),0.74～0.77(m,1H,H-10);13C NMR(acetone-d6,125MHz),δ:168.49(C-1),157.16(C-22),144.19(C-26),139.50(C-16),135.67(C-13),134.77(C-19),131.94(C-24),128.05(C-18),125.78(C-17),122.79(C-23),122.77(C-25),121.40(C-12),113.81(C-21),97.28(C-4),75.67(C-5),67.70(C-9),67.44(C-2),48.43(C-14),41.44(C-3),36.70(C-10),36.14(C-15),35.60(C-8),34.33(C-6),33.69(C-11),27.83(C-7),25.63(C-27),21.14(C-31),17.57(C-20),17.15(C-29),15.40(C-30),14.76(C-32),9.54(C-28)。

2.4.3 A3碱降解杂质

样品质谱图中m/z=509.4380的离子峰为[M+H]+的峰，表明该杂质的分子量为508.6550，高分辨质谱确定[M+H]+509.4380峰的元素组成为C31H41O6，证明本品的元素组成为C31H40O6。核磁共振碳谱中共有31个碳信号，分别为5个伯碳原子，7个仲碳原子，10个叔碳原子，9个季碳原子。具体归属如下：

1H NMR(acetone-d6,400MHz),δ:9.53(s,1H,H-22-OH),6.92(s,1H,H-24),6.17～6.20(m,1H,H-18),5.92～6.01(m,1H,H-17),5.53(dd,1H,H-16),5.24～5.31(m,3H,H-2-20),5.07～5.09(m,1H,H-12),3.57～3.66(m,1H,H-9),3.25～3.30(m,1H,H-5),2.46～2.56(m,1H,H-15),2.24～2.31(m,1H,H-14),2.10～2.18(m,6H,H-10-11-31),2.04～2.07(m,1H,H-3),1.84～1.90(m,1H,H-14),1.55～1.56(m,1H,H-8),1.43～1.47(m,6H,H-7-8-29),1.18～1.21(m,2H,H-3-6),1.13(d,3H,H-27),0.99(d,3H,H-30),0.85～0.91(m,1H,H-10),0.80(d,3H,H-28);13C NMR(acetone-d6,125MHz),δ:167.14(C-1),151.32(C-21),143.13(C-22),142.91(C-16),123.34(C-18),122.35(C-12),117.49(C-25),97.66(C-4),74.25(C-20),71.10(C-5),69.10(C-2),67.80(C-9),48.29(C-14),41.49(C-3),36.53(C-6),36.06(C-10),35.54(C-8),35.41(C-15),34.32(C-11),27.81(C-7),22.54(C-30),19.83(C-27),18.22(C-28),16.01(C-31),15.51(C-29)。

2.4.4 A4碱降解杂质

样品质谱图中m/z=523.4401的离子峰为[M+H]+的峰，表明该杂质的分子量为522.682，高分辨质谱确定[M+H]+523.4401峰的元素组成为C32H43O6，证明本品的元素组成为C32H42O6。核磁共振碳谱中共有32个碳信号，分别为5个伯碳原子，8个仲碳原子，10个叔碳原子，9个季碳原子。具体归属如下：

1H NMR(acetone-d6,400MHz),δ:9.60(s,1H,H-22-OH),6.93(s,1H,H-24),6.19～6.22(m,1H,H-18),5.94～6.01(m,1H,H-17),5.52(dd,J=9.6Hz,9.8Hz,1H,H-16),5.19～5.34(m,3H,H-2-20),5.04～5.07(m,1H,H-12),3.61～3.67(m,1H,H-9),3.04～3.09(m,1H,H-5),2.44～2.55(m,1H,H-15),2.23～2.25(m,1H,H-14),2.06～2.17(m,7H,H-3-10-11-32),1.87(t,J=11.8Hz,1H,H-14),1.65～1.70(m,1H,H-27),1.55～1.56(m,1H,H-8),1.47(s,3H,H-30),1.43～1.44(m,3H,H-7-8),1.18～1.35(m,3H,H-3-27-6),0.96～1.0(m,6H,H-28-31),0.83～0.92(m,1H,H-10),0.78(d,J=6.2Hz,3H,H-29);13C NMR(acetone-d6,125MHz),δ:167.07(C-1),151.33C-21),143.16(C-22),142.89(C-16),136.68(C-13),132.63(C-19),126.08(C-23),125.57(C-24),124.97(C-17),124.23(C-26),123.35(C-18),122.24(C-12),117.50(C-25),97.48(C-4),75.73(C-5),74.23(C-20),69.07(C-2),67.78(C-9),48.24(C-14),41.69(C-3),36.15(C-10),35.45(C-8),35.37(C-15),34.37(C-6),34.31(C-11),27.98(C-7),25.70(C-27),22.49(C-31),18.08(C-29),16.02(C-32),15.53(C-30),10.50(C-28)。

4个杂质的结构式及1H-1H COSY和HMBC相关信号图如图5～6所示。

2.5 杂质的来源及去向分析

为了进一步确认杂质E、F与5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分碱降解杂质是否存在对应关系，采用液质联用检测分析了5-酮基米尔贝霉素A3/A4粗品溶液。

杂质E对应的质谱图中m/z=509.4320的离子峰为[M+H]+的峰，表明该杂质的分子量为508.6，高分辨质谱确定[M+H]+509.4320峰的元素组成为C31H41O6，推测该杂质的元素组成为C31H40O6，分子量和分子式与A3碱降解杂质相同。杂质F对应的质谱图中m/z=523.4401的离子峰为[M+H]+的峰，表明该杂质的分子量为522.6，高分辨质谱确定[M+H]+523.4401峰的元素组成为C32H43O6，推测该杂质的元素组成为C32H42O6，分子量和分子式与A4碱降解杂质相同。这就证实了杂质E即为A3碱降解杂质，杂质F即为A4碱降解杂质。这两个杂质在粗品溶液中含量较少，可见碱性条件能加速A3、A4分别降解成E、F这两个杂质。

对比5-酮基米尔贝霉素A3/A4及杂质C～F结构式可以看出：(1)杂质C为A4第6、27位碳之间的氧开环后的产物；杂质D的结构就是杂质C的酮基转变成更加稳定的烯醇式结构。这与Nonaka等[13]的研究分析一致，杂质C即文献中的杂质Milβ6(1b)，杂质D即文献中的杂质Milβ3(5b)。杂质C含有酮基可参与肟化反应，如图7所示，杂质D不含酮基，因此不能进行肟化反应，这也正好与肟化实验结果相符。

图5 4个杂质及5-酮基米尔贝霉素A3/A4的结构式Fig.5 The structural formula of the four impurities and 5-keto milbemycin A3/A4

图6 4个杂质的1H-1H COSY和HMBC相关信号图Fig.6 1H-1H COSY and HMBC correlations of the four impurities

杂质C肟化后的产物也有部分残留于最终的米尔贝肟成品中；杂质D不能肟化，在肟化反应后的纯化步骤中去除较彻底。

(2)A3碱降解杂质(杂质E)及A4碱降解杂质(杂质F)分别为A3、A4的5位上酮基转变为烯醇式结构的产物，如图8所示。杂质F即为Wang等[14]公开的米尔贝霉素α31。

杂质E、F都不含酮基，故不能进行肟化反应，在肟化反应后的纯化步骤中去除较彻底。

3 结论

由此可见，中间体5-酮基米尔贝霉素中杂质C的含量对成品米尔贝肟的杂质含量会有较大影响，所以对5-酮基米尔贝霉素中杂质C的限度应进行进一步研究。

图7 杂质C肟化反应Fig.7 The oximation reaction of impurity C

图8 5-酮基米尔贝霉素A3/A4碱降解Fig.8 The alkaline degradation of 5-keto milbemycin A3/A4

上述相关杂质的结构确证及相互间的关系，可以为5-酮基米尔贝霉素生产工艺改进、质量标准完善以及产品质量提高提供参考。对于会参与肟化反应生成米尔贝肟相关杂质的5-酮基米尔贝霉素相关杂质的杂质谱还需要更详细的研究，以便确定相关杂质的限度。