谢文娟，吴殿辉，李晓敏，蔡国林，谢广发，陆健*

1(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)2(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)3(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122) 4(浙江树人大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州，310015)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)，又名尿烷(urethane)，不易挥发，溶于水和有机溶剂(乙醇、氯仿、乙醚、苯等)[1]。EC普遍存在于腐乳、酱油等发酵食品及清酒、黄酒、葡萄酒、威士忌、白兰地等酒精饮料中[2-4]，被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)列为2A类致癌物质，而且限定了其使用范围[5]。鉴于酒精饮品是人体摄入EC的主要来源，加拿大和捷克等国家纷纷对市场上各类酒精饮品中EC的含量规定了限量标准[6]。

黄酒中的EC主要是是由尿素和乙醇自发反应生成的，黄酒发酵液中尿素含量的多少直接影响EC含量的高低[7]。因而，降低发酵液中尿素的含量是减少黄酒中EC含量的首要途径。黄酒中的尿素主要由酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的精氨酸酶(由CAR1编码)降解精氨酸生成。尿素既可以被脲基酰胺酶(由DUR1,2编码)水解为NH3和CO2，也可以被分泌到胞外进入发酵醪液。在氮源不足的情况下，由DUR3基因编码的转运蛋白可以将发酵液中的尿素转运至胞内，作为氮源供酿酒酵母生长和代谢所用。在降低发酵酒中尿素含量的探索中，更多的学者集中在对精氨酸酶、脲基酰胺酶以及尿素转运蛋白的单一代谢改造研究，通过敲除CAR1[8-10]、过表达DUR1,2[11-12]或DUR3[13-14]等策略来降低发酵酒中尿素的含量。也有学者对其中的2个基因同时进行改造以降低发酵酒中尿素的含量[15]。分别改造CAR1、DUR1,2、DUR3基因或者双重改造可以在一定程度上降低发酵酒中尿素和EC的含量，但是目前尚未见对3个基因同时进行代谢改造以降低发酵液中尿素含量的研究。

本研究将酿酒酵母PGK1(3-磷酸甘油酸激酶基因)的强启动子(PGK1p)作为调控元件，组建DUR3过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”，利用CRISPR/Cas9技术[16-17]转化已经改造过CAR1和DUR1,2基因的单倍体菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1，通过同源重组在HO基因位点插入DUR3过表达组件，以期构建进一步降低发酵液中尿素含量的酵母工程菌，从而减少黄酒中EC的形成，提高黄酒的饮用安全性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109、pMGKR质粒(携带酿酒酵母PGK1的强启动子PGK1p)由本实验室保存。单倍体黄酒酵母S.cerevisiaeNa(MATa)和工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1(MATaura3car1::ura3 Φ(DUR1,2-URA3-PGK1p))由本实验室分离和构建[18-19]。其中单倍体S.cerevisiaeNa是通过敲除二倍体黄酒酵母N85的HO基因分离获得[18]，工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1是通过敲除S.cerevisiaeNa菌株的CAR1基因和过表达DUR1,2基因获得[19]。CRISPR/Cas9质粒含有核酸酶Cas9蛋白和G418抗性基因KanMX，购于Addgene公司。sgRNA转录表达框由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.2 培养基

YPD培养基、LB培养基、G418筛选培养基(YPD加入350 μg/mL G418硫酸盐)分别用于酵母菌的培养和保存、大肠杆菌的培养和保存、酵母转化子的筛选。

1.1.3 酶和主要试剂

Prime STAR DNA polymerase、ExTaqDNA polymerase、rTaqDNA polymerase、T4 DNA Ligase、SphI、NotI、pMD19-T Vector：宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒，DNA胶回收试剂盒，氨苄青霉素(Amp)，G418硫酸盐：生工生物工程(上海)有限公司；引物合成及DNA片段测序均由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.1.4 主要仪器

Powerpac Basic高电流电泳仪、Mastercycler pro PCR仪，德国Eppendorf公司；JD-801凝胶成像仪，江苏省捷达科技发展有限公司；Gene Pulser Xcell电击转化仪，美国Bio-Rad公司；Agilent 1260高效液相色谱仪、ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)色谱柱，美国Agilent公司。

1.1.5 引物设计及合成

按照酿酒酵母S.cerevisiaeS288C的PGK1p、HO与DUR3基因的核苷酸序列，设计表1中的扩增引物。

表1 实验中用到的引物Table 1 Primers used in the study

注：下划线表示用于融合PCR的重叠序列；*表示加粗斜体为SphI酶切位点；#表示加粗斜体为NotI酶切位点

1.2 实验方法

1.2.1 酿酒酵母DUR3基因过表达组件的构建

本研究基于融合PCR的原理，将酿酒酵母DUR3基因置于其自身的强启动子PGK1p调控之下。DUR3基因过表达组件的构建如图1所示。

图1 DUR3基因过表达组件的组建示意图Fig.1 Illustration of the construction of DUR3 over-expression cassette

首先，提取酿酒酵母S.cerevisiaeNa的基因组作为模板，分别以HO-L-1/HO-L-2，HO-R-1/HO-R-2，DUR3-1/DUR3-2为引物，扩增HO上游同源臂(HOL)、HO下游同源臂(HOR)和DUR3片段。以PGK1p-F/PGK1p-R，PGK1t-F/PGK1t-R为引物，pMGKR质粒为模板，PCR扩增获得PGK1基因的启动子PGK1p和终止子PGK1t。以HOL、HOR、PGK1p、DUR3、PGK1t为模板，HO-L-1/HO-R-2为引物，采用一种已报道的构建基因组件的高效方法[14]获得DUR3过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”。

1.2.2 CRISPR-DUR3质粒的构建

以HO-F/gRNA-R为引物，以HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR、sgRNA转录表达框为模板，采用一种已报道的构建基因组件的高效方法[18]，由融合PCR得到DUR3基因过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR-sgRNA”。经琼脂糖凝胶电泳验证后进行T克隆，得到质粒pMD19-DUR3-sgRNA，并测序验证其序列的正确性。

质粒CRISPR-Vector与pMD19-DUR3-sgRNA分别经SphI和NotI双酶切(图2)，琼脂糖凝胶电泳后回收线性化的质粒CRISPR-Vector (13466 bp)和DUR3-sgRNA片段(4537 bp)，利用T4 DNA连接酶连接并转化E.coliJM109构建CRISPR-DOR3质粒，挑取阳性克隆子提取质粒DNA，经PCR和酶切，送样测序验证。

图2 CRISPR-DUR3质粒的构建Fig.2 Construction of CRISPR-DUR3

1.2.3 电转化单倍体S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1以及转化子的鉴定

将构建的质粒CRISPR-DUR3通过高效电转化法转化酿酒酵母S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1[20-22]，并涂布于G418筛选培养基，30 ℃培养至长出转化子，以HO-L-1/HO-R-2为引物进行菌落PCR初步验证，并提取阳性转化子的基因组，以HO-L-1/HO-R-2为引物再次验证，送样测序验证。

将阳性转化子转接到不含抗性的YPD液体培养基连续培养10代以上，丢失CRISPR-DUR3质粒，最终得到不含外源抗性基因的酿酒酵母工程菌。

1.2.4 工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1中DUR3基因转录水平验证

1.2.5 实验室规模黄酒酿造实验

分别以出发菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1、亲本菌株S.cerevisiaeNa及本研究构建的酿酒酵母工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1进行黄酒酿造实验。黄酒发酵工艺流程按照文献进行[24]。

1.2.6 黄酒发酵液指标测定

黄酒发酵液中氨基酸态氮、pH值、总酸、酒精度和总糖等指标的测定按照国标GB/T13662-2008黄酒的测定方法[25]。

1.2.7 黄酒发酵液中尿素含量的测定

采用高效液相色谱法，结合荧光检测器测定黄酒发酵液中尿素的含量[26]。

1.2.8 黄酒发酵液中EC含量的测定

发酵液中EC含量的测定采用固相萃取-同位素稀释法[2]。

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母工程菌的构建与鉴定

2.1.1DUR3基因过表达组件及CRISPR-DUR3质粒的构建与鉴定

按照1.2.1中所述的融合PCR方法获得DUR3基因过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”。由图3的琼脂糖凝胶电泳结果表明，PCR扩增获得的DUR3过表达组件大小为4 087 bp，与预期片段大小相符，并通过测序验证了其序列的正确性。然后，按照1.2.2的方法，将含有DUR3基因过表达组件的T克隆质粒与CRISPR-Vector分别进行双酶切，在DNA连接酶的作用下构建含有DUR3过表达组件和sgRNA片段的CRISPR-DUR3质粒，并通过测序验证了其序列的正确性。

M-5kb Marker; 1- DUR3过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”的PCR产物图3 DUR3基因过表达组件的PCR验证Fig.3 The verification of DUR3 overexpression cassette by PCR

2.1.2 过表达DUR3基因的酿酒酵母工程菌的构建

因CRISPR-DUR3质粒带有G418抗性，因此，CRISPR-DUR3质粒成功转化S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1后获得的酿酒酵母转化子可以在G418筛选培养基上生长。提取阳性转化子的基因组，用HO-L-1/HO-R-2作为引物进行PCR扩增验证,如图4所示。

M-5kb Marker；1-以S. cerevisiae NaDUR1,2-Δcar1的基因组为模板的PCR产物；2-以S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1的基因组为模板的PCR产物图4 酵母工程菌转化子的PCR鉴定电泳图Fig.4 Screening of transformations of overexpression cassette by PCR

阳性转化子可以扩增出1条4 087 bp大小的片段，与基因表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”的大小相符；而阴性对照则只能得到1049 bp大小的HO基因片段。回收和纯化4 087 bp大小的片段后，经测序验证了其序列的正确性。表明DUR3过表达组件在CRISPR/Cas9的作用下成功整合到S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1菌株的基因组。获得的酵母工程菌命名为S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1。由图5可知，将工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1在YPD培养基中连续传代培养10代以后，工程菌不能在含有G418的平板上生长，说明CRISPR-DUR3质粒已丢失，工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1不含外源抗性基因。

A-工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1在YPD平板上的培养结果； B-工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1在G418筛选培养基平板上的培养结果图5 连续传代培养10代后酿酒酵母工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1在不同培养基平板上的培养结果Fig.5 The growth of modified strain S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1 on different medium plate after 10 generation of continuous culture

2.2 工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1中DUR3基因转录水平验证结果

如图6所示,DUR3基因过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”在酵母基因组重组后，构建的工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1的DUR3基因表达水平提高，相较出发菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1，在12、24、36、48 h，DUR3基因的转录水平分别提高了2.1倍、3.7倍、2.3倍和2.2倍，说明强启动子PGK1p的插入明显提高了工程菌DUR3 基因的转录水平。

图6 代谢改造对酵母DUR3基因表达量的影响Fig.6 Effects of metabolic engineering on the expression of DUR3

2.3 酿酒酵母工程菌发酵性能的验证

将构建的工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1与亲本菌株S.cerevisiaeNa及出发菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1分别进行实验室三角瓶黄酒发酵实验，考察工程菌在黄酒发酵过程中的生长和发酵性能。由CO2失重曲线(图7)可知，工程菌与亲本菌株和出发菌株的失重曲线一致，说明其发酵能力与亲本菌株和出发菌株基本相同。

图7 工程菌黄酒发酵过程中CO2失重曲线Fig.7 Loss weight of CO2during the fermentation of Chinese rice wine by engineered strain

由表2检测结果可知，工程菌与亲本菌株和出发菌株发酵液的总糖、总酸、氨基酸态氮和酒精含量以及pH值基本没有差异，说明对出发菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1的DUR3基因进行代谢工程改造没有影响其生长和发酵性能。

2.4 酿酒酵母工程菌降低发酵液中尿素和EC能力的考察

如表2所示，过表达DUR3基因的酵母工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1发酵液中尿素的含量为(3.0±0.4)mg/L，与亲本菌株S.cerevisiaeNa(38.0±0.8) mg/L和出发菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1(5.3±0.5)mg/L相比，分别降低了92.1%和43.4%。

表2 黄酒发酵液中理化指标及尿素和EC含量的测定Table 2 Measurement of the concentrations of metabolites and urea and EC in Chinese rice wine samples by different strains

尿素是黄酒发酵液中EC形成的主要前体物质，因此工程菌发酵液中EC含量也显著降低(表2)。与亲本菌株和出发菌株相比，S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1发酵液中EC含量[(17.1±1.2)μg/L]分别降低了58.6%和16.2%。说明过表达DUR3基因的酿酒酵母工程菌可以在黄酒发酵过程中吸收醪液中的尿素，从而进一步降低了发酵液中尿素的含量，减少了EC的形成。

3 讨论

酿酒酵母HO基因能够使单倍体的接合型MATa和MATα发生转变，然后与周围的单倍体发生同宗融合形成二倍体，而该基因的表达对酵母自身的生长和代谢并无影响。本研究将构建的DUR3基因过表达组件通过同源重组整合在酿酒酵母基因组的HO位点，可以在不影响酵母生长和代谢的情况下实现DUR3基因的过表达。此外，借助CRISPR/Cas9基因组编辑系统和一段短的单链引导RNA (single guide RNA, sgRNA)对酿酒酵母特定的DNA序列进行识别并高效编辑，无外源基因残留于酵母基因组上，具有生物安全性。

氨基甲酸乙酯(EC)是存在于黄酒中的潜在致癌物，主要由尿素和乙醇自发反应形成。所以降低发酵液中尿素的含量可以从根源上减少黄酒中EC的形成。黄酒中大部分的尿素是由酿酒酵母在发酵过程中代谢精氨酸产生，而酿造原料也会带入少量尿素。因此，本研究以前期构建的工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1为出发菌株，在敲除CAR1和过表达DUR1,2基因的基础上过表达DUR3基因，成功构建具有“尿素吸收”功能的工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1。实验结果表明，与出发菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1相比，工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1的DUR3基因表达量显著提高，而且黄酒发酵液中尿素和EC的含量分别降低了43.4%和16.2%。说明在黄酒发酵过程中，工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1在不影响酿酒酵母生长和发酵性能的前提下，不但可以减少酿酒酵母代谢产生的尿素，还可以将发酵醪液中由原料带入的尿素转运至酵母胞内，从而进一步降低发酵液中尿素的含量，减少EC的形成，具有工业化应用的潜在可能性。