李丹娜,王丽莹,牟晓凤,刘 攀,柳亚男,李 涛,孙晓燕,王 军,赵 烽

(1烟台大学新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心、分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),山东 烟台 264005;2烟台鲁银药业有限公司,山东 烟台 264000)

洋金花(Daturae Flos)为茄科植物白曼陀罗(DaturametelL.)的干燥花,在临床上用于外科麻醉、银屑病、癫痫、精神分裂症、小儿肺炎、慢性支气管炎等症状[1],分布在我国东北、华北、华东、中南及陕西、新疆、四川、贵州、云南地区．洋金桔的主要有效成分为莨菪烷类生物碱,其中东莨菪碱的含量约占85%,为含量最高的生物碱[2]．关于测定东莨菪碱含量的方法,文献已报道的有中和滴定法[3]、薄层扫描法[4]、毛细管电泳法[5]及高效液相色谱法等[6-7]．PENG 等[8]从洋金花中通过微波辅助提取法(MAE)、浸渍提取法(SE)和回流提取法(BE)提取出来的东莨菪碱的含量分别为0.24%、0.24%和0.13%．付传香等[9]对色谱柱、波长、流速和流动相进行选择,得到与SGE protecol C18(5 μm,4.6×100 mm)和SGE protecol C8(5 μm,4.6×250mm)相比,另一种传统定量分析色谱柱SGE protocol C18(5 μm,4.6×250 mm)能更准确地分离出东莨菪碱,且分离度大于1.5,为2.1;进行全波长扫描时,在216 nm处待测组分响应值最大且分离度符合要求．研究并优化从洋金花中提取东莨菪碱的方法,可为制备高纯度东莨菪碱奠定研究基础．

本文对高效液相色谱法测定东莨菪碱的含量进行了方法学研究,对不同产地的洋金花进行质量评价,并分别采用常规酸水浸渍[10]、常规乙醇浸渍[11]、有机溶剂回流提取法[12]、超声波辅助二氯甲烷提取法[13]对药材进行提取,HPLC法测定各提取物中东莨菪碱的含量,确定提取东莨菪碱的最佳方法．

1 实验材料

1.1 仪器

Agilent 1100单元泵高效液相色谱仪,ODS-色谱柱(4.6×250 mm, 5 μm),安捷伦工作站,G1310A单元泵(DE23905769),G1314A检测器(JP24021101);电子天平(BS224S型,上海亚津电子科技有限公司);超声提取器(KQ-300DE型,昆山市超声仪器有限公司);双显恒温加热磁力搅拌器(SH-3型,北京金紫光科技发展有限公司);pH计(PHS-3FA型,上海博取仪器有限责任公司);旋转蒸发仪(RE-52AA型,上海亚荣生化仪器厂);台式高速冷冻离心机(Model型,湖南凯达科学仪器有限公司)．

1.2 药材与试剂

洋金花药材产地分别为江苏、广东、四川、湖南、云南、河北、山东;氢溴酸东莨菪碱对照品(纯度≥98%)购自成都瑞芬思生物科技有限公司;乙腈、甲醇(色谱纯,德国Merck公司);磷酸钠、十二烷基硫酸钠、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醇、盐酸、浓氨水均为分析纯．

2 方 法

2.1 不同方法从洋金花药材中提取东莨菪碱

2.1.1 酸水浸渍法(药典记载方法) 取洋金花药材粉碎,过三号筛(50目),取该药材过筛粉末1 g,用10 mL的2 mol/L 盐酸溶解,超声振荡(功率250 W,频率40 kHz,提取30 min)放至室温,用2 mol/L盐酸溶液10 mL分数次洗涤锥形瓶和滤饼,合并滤液和洗涤液,得供试品Ⅰ．

2.1.2 乙醇浸渍法 取洋金花粉末100 g,用75 %的乙醇1 400 mL浸渍2次,每次75 h,滤过,回收乙醇,得浸膏,真空低温(t=45 ℃) 干燥至恒定质量, 精密称定为21.04 g．取浸膏0.210 g,加蒸馏水10 mL,调pH值为2～3,溶解、滤过,得供试品Ⅱ．

2.1.3 超声波辅助二氯甲烷提取 取洋金花药材粉碎,过三号筛(50目),取该药材过筛粉末1 g,加氨水2 mL,二氯甲烷10 mL,超声处理30 min,滤过,蒸干,用三氯甲烷复溶,加水10 mL,调pH值为2～3,反复萃取2次,合并酸水相,得供试品Ⅲ．

2.1.4 有机溶剂回流提取法 取洋金花粉末100 g,用75% 的乙醇回流2次,每次加700 mL溶剂,第一次回流2 h,第二次回流1.5 h,合并提取液,浓缩得浸膏,真空低温(t=45 ℃) 干燥至恒定质量,精密称定为25.68 g．取浸膏0.257 g,加水10 mL,调pH值为2～3,溶解、过滤,得供试品Ⅳ．

2.2 溶液配制

2.2.1 氢溴酸东莨菪碱对照品溶液的配制 精密称定氢溴酸东莨菪碱对照品5.54 mg,置于10 mL容量瓶中,加流动相溶解,并定容至刻度,即得0.554 mg/mL对照品溶液．

2.2.2 供试品溶液的配制 分别取供试品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,用浓氨水调节pH值到9.0左右,然后用40 mL的三氯甲烷分4次萃取,合并萃取液,置于旋转蒸发仪回收三氯甲烷,残渣用流动相溶解,转移至5 mL容量瓶中,加流动相至刻度,摇匀,用0.22 μm的滤膜过滤,取滤液为供试品溶液．

2.3 色谱条件[10]

流动相为0.07 mol/L磷酸钠溶液-乙腈(100∶50);检测波长为216 nm;流速为1.0 mL/min;进样量为20 μL;理论塔板数按东莨菪碱峰计算应不低于3 000．在上述色谱条件下,待测组分可以和其他组分达到基线分离,保留时间约为11.0 min．

3 结果与分析

3.1 线性关系实验

精密称取氢溴酸东莨菪碱对照品28.90 mg,置于50 mL容量瓶中加入流动相定容至刻度,摇匀．分别精密吸取3、5、7、9、10 mL,置于10 mL容量瓶中,加入流动相定容至刻度,摇匀,即得．在上述色谱条件下,分别精密吸取20 μL注入到色谱仪中,测定峰面积积分值,用对照品溶液的进样量作为横坐标,峰面积积分值作为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程:Y=981.67X+992.86(r=0.998 9)．

结果表明,氢溴酸东莨菪碱在1.2～4 μg范围内,峰面积积分值与进样量呈现良好的线性关系．

3.2 精密度考察

在上述色谱条件下,精密吸取“2.2.1”中对照品溶液20 μL,重复进样5次,测定其峰面积值．结果RSD=0.91 %,由此表明,本法有较好的精密度．

3.3 稳定性考察

取同一供试品溶液,配制后,分别于0、2、4、6、8、12、24、48、72 h进样,依法测定其峰面积,测定结果无显著变化,RSD=1.44 %,表明供试品在72 h内基本稳定．

3.4 重现性试验

取同一个来源地的洋金花药材,按照“2.1.1”方法操作,平行5份,在上述色谱条件下测定峰面积,考察方法的重现性,结果RSD=1.16 %,表明此方法具有良好的重现性．

3.5 酸水浸渍法测定不同产地洋金花中东莨菪碱

的含量

取江苏、湖南、云南、广东、四川、河北、山东7个不同产地的洋金花,按照“2.2.2”方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下测定峰面积,并计算东莨菪碱的含量,结果如表1．

3.6 加样回收率试验

取同一产地已知东莨菪碱含量的洋金花药材约0.5 g各5份,精密称定,分别加入“2.2.1”对照品溶液(东莨菪碱相当于0.4 mg/mL)各2.0 mL,按照供试品溶液的配制方法平行配制,在上述色谱条件下进样20 μL,进行测定,计算加样回收率(表2),得到平均回收率为98.92%．

表1 不同产地洋金花中东莨菪碱的含量测定(n=3)

Tab.1 Determination of scopolamine content in Daturae Flos from different areas(n=3) %

表2 加样回收率(n=5)

3.7 对不同提取方法提取效果的考察

不同产地洋金花中东莨菪碱的含量测定结果表明,四川产地药材中东莨菪碱的含量符合药典标准且易购买,因此选取四川产地的洋金花药材,按上述供试品溶液的制备方法,制备供试品溶液,在上述色谱条件下测定峰面积,并计算东莨菪碱的含量,结果如表3．

表3 不同提取方法对东莨菪碱提取效率的影响(n=3)

Tab.3 Effect of different methods on the extraction efficacy(n=3) %

4 讨 论

由于药材来源受限,本研究仅测定了7个不同产地洋金花药材中东莨菪碱的含量,对药材进行了质量评价．实验结果表明,不同产地洋金花中东莨菪碱的含量高低为:江苏>湖南>云南>广东>四川>河北>山东,高含量约为低含量的3倍左右,说明洋金花药材中东莨菪碱的含量易受地域环境的影响．2015版药典规定,洋金花中东莨菪碱的含量应高于0.15%．本研究测定的7个产地的洋金花药材中,有5个产地的符合药典要求,但是河北与山东产地的洋金花药材中东莨菪碱的含量未达到药典规定标准,更多产地洋金花药材中东莨菪碱的含量还有待于进一步测定,并且尚未进行花中与其他部位中东莨菪碱含量的横向比较．鉴于不同产地洋金花药材中东莨菪碱的含量参差不齐,在临床应用过程中,要格外注意洋金花的质量控制,防止中毒事件的发生．

通过文献调研发现,药典所记载酸水浸渍法未必即是从洋金花中提取东莨菪碱的最佳方法,有机溶剂浸渍、回流等方法[9-10]提取东莨菪碱的效率均有可能优于酸水浸渍法．本研究通过对4种提取方法进行比较,发现在东莨菪碱的提取效率上,乙醇回流提取法>超声波辅助二氯甲烷提取法>常规乙醇浸渍法>常规酸水浸渍法．乙醇回流提取法的提取效率最高,可以达到常规酸水提取法的2倍．提示在洋金花药材中东莨菪碱含量受限的情况下,可以通过采用有机溶剂回流法提取洋金花中的东莨菪碱,从而提高收率,降低成本,并且乙醇回流提取法也适用于工业化生产．

综上,本文对HPLC法测定洋金花药材中东莨菪碱的含量进行了方法学研究,结果表明方法简便可行,准确度高,可广泛用于洋金花药材的质量控制．有机溶剂回流法可用于建立经济、合理、可控的东莨菪碱的工业化提取工艺．