张华 孙颖颖 于晨

摘要：以鸭梨果实为实验材料，研究了哈茨木霉对贮藏在常温条件（20±1°C）下鸭梨果实采后青霉病的抑制效果及相关机理。结果表明，哈茨木霉显著抑制了青霉病的发病率和病斑直径。哈茨木霉处理提高了鸭梨果实中几丁质酶（chitinase，CHI）和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase，GLU）的活性，诱导了鸭梨果实中过氧化氢酶（catalase，CAT）、多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）等抗病相关酶活性的提高。哈茨木霉通过诱导提高抗病性相关酶活性，从而减轻鸭梨果实采后青霉病的发生。

关键词：哈茨木霉;鸭梨;青霉病;诱导抗病性

中图分类号 TS255.3文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）12-0084-3

Abstract：The effects of Trichoderma harzianum on blue mold decay in harvested Yali pear fruit stored at 20±1°C and the possible mechanisms were investigated. The results showed that fruit treated with Trichoderma harzianum had significantly lower disease incidence and smaller lesion diameter than the control fruit did. Trichoderma harzianum treatment significantly enhanced activities of chitinase（CHI），β-1，3-glucanase（GLU），catalase（CAT），peroxidase（POD），and polyphenoloxidase（PPO）. The experimental results suggested that Trichoderma harzianum could effectively suppress blue mold decay in pear fruit may be related to the induction o f defensiv e enzyme activities.

Key words：Trichoderma harzianum;Pyrus bretschneideri;Blue mold decay;Induced disease resistance

鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd.）是白梨系统中的优良品种，果实皮薄多汁，营养丰富，受到国内外消费者的欢迎，每年需求量巨大，但果实在贮藏期间易发生真菌病害，造成了巨大的损失，影响果实的贮藏和销售。其中由扩展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是鸭梨采后贮藏的主要真菌病害之一[1]。对于水果采后真菌病害的防治，传统的方法是依靠人工合成的化学杀菌剂，但长期使用会造成真菌产生抗药性以及农药残留，随着人们环境保护意识的提高，通过生物防治的方法抑制采后病害的发展成为研究热点。

木霉菌是防治效果非常好的生防真菌，其抗性效果在多种植物中都有报道。哈茨木霉（Trichoderma harzianum）属于半知菌门丝孢目木霉属，广泛存在于不同环境中的土壤中。众多的研究结果表明，哈茨木霉在农作物上的使用可抑制植物病原真菌、细菌、昆虫等有害生物，同时还可以促进农作物的生长，被广泛应用于生物防治[2]，但关于哈茨木霉对鸭梨果实采后青霉病的抑制效果及相关机理尚未见报道。因此，本试验研究了哈茨木霉对鸭梨果实采后青霉病的抑制效果和相关机理，以期为哈茨木霉在水果采后贮运中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验处理 哈茨木霉在PDA培养基（马铃薯：200g;葡萄糖：20g;琼脂：20g;水：1000mL）上扩大培养15d，使用血球计数板配置浓度为1×108个/mL的孢子悬浮液。将青霉菌孢子接种于PDA培养基上扩大培养7d，使用血球计数板配置浓度为5×104个/mL的孢子悬浮液。鸭梨果实采摘自山东省聊城市冠县果园，选择大小、成熟度一致，无物理损伤和病虫害的果实，随机分成2组，为避免交叉感染，先用75%的酒精擦拭鸭梨果实表面需要接种的部位，用无菌打孔器在果实的赤道部位打孔（深4mm，直径2mm）。处理组用移液枪注入25?L的哈茨木霉孢子悬浮液，对照组注入等量的无菌水，2h后在打孔处注入15?L的青霉菌孢子菌悬液。处理完毕后，用0.01mm厚的聚乙烯保鲜袋分装果实，将果实贮藏于20±1°C、相对湿度为90%的生化培养箱中5d，在贮藏的第1、3、5d测量鸭梨果实的发病率和病斑直径，同时取果实病斑外围2～10mm的样品，测定其它生化指标，每个处理20个果实，重复3次。

1.2 试验方法

1.2.1 鸭梨的发病率和病斑直径的测定 使用游标卡尺测量鸭梨果实的病斑直径，当病斑直径大于2mm时，认定为是发病，发病率（%）=（发病果个数/果实总数）×100。

1.2.2 鸭梨果实组织中抗病相关酶活性的测定 称取1g鸭梨果实组织，冰浴条件下用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（5mL，pH5.0）匀浆，4℃离心（12000r/min）15min，所得上清液用于测定几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性。根据王雷等的方法[3]，以每分钟增加0.001个光密度所需要的酶量为1个几丁质酶活力单位;以每小时生成1mg葡萄糖为1个β-1，3-葡聚糖酶活力单位，结果表示为U mg-1protein。CAT的活性按照Liu等[4]的方法进行测定，以反应液每分钟在240nm处吸光值变化0.001为1个酶活力单位，结果表示为U mg-1protein。PPO和POD的活性依据Jiang等[5]所述方法测量，使用磷酸钠缓冲液（0.2M，pH6.5）匀浆1g水果组织并离心，反应体系中包含0.1mL上清液，0.2mL的邻苯二酚，在420nm处测定吸光度值，每分钟增加0.01为1个酶活力单位。测定POD活性时，吸光度值在470nm处的每分钟变化为0.01为1个酶活力单位，结果表示为U mg-1protein。蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[6]。

1.3 数据统计 采用SAS 9.3对实验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 对鸭梨果实青霉病的抑制效果 由扩展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是鸭梨采后贮藏的主要真菌病害，其引起的腐烂造成了巨大的经济损失。如图1所示，鸭梨果实在采后常温（20±1°C）贮藏过程中，通过穿刺接种青霉菌后，腐烂的发病率和病斑直径表现出了上升的趋势，接种哈茨木霉处理能够抑制鸭梨果实青霉病的扩展，这说明哈茨木霉处理可以控制鸭梨果实采后的青霉病。贮藏5d后，处理组果实的病斑直径比对照组果实少49.6%。

2.2 对鸭梨果实CHI和GLU活性的影响 由图2可见，对照组和处理组的鸭梨果实组织中几丁质酶活性在贮藏的前3d急剧上升，随后略有下降。与对照组相比，整个贮藏过程中接種哈茨木霉能够显著提高鸭梨果实的几丁质酶活性。处理组鸭梨果实的β-1，3-葡聚糖酶活性表现出逐渐上升的趋势，而对照组在第1天上升随后略有下降，处理组在整个贮藏期内都显著高于对照组。这2种酶是非常重要的抗性酶，可以破坏病原菌的细胞壁，从而抑制病原菌的生长。多种采后处理方式在草莓[3]、葡萄[5]等水果上都通过诱导提高了这2种抗性酶活性，最终提高果实的抗病性，减少采后病害的发生。

2.3 对鸭梨果实CAT活性的影响 鸭梨果实组织中CAT活性在贮藏的前3天迅速上升，随后处理组果实略有上升而对照组的活性略有下降，在整个实验中，哈茨木霉处理组的果实CAT活性都显著高于对照果实。水果的抗病性与CAT活性密切相关，CAT是植物体内清除活性氧系统的主要酶，活性氧自由基的积累会降低水果的抗病性。众多的研究结果表明，提高果实中CAT的活性，有助于提高果实的抗病性[5，7]。

2.4 对鸭梨果实POD和PPO活性的影响 由图4可见，鸭梨果实的POD活性先上升随后下降，处理组果实显著高于对照组。处理组鸭梨果实的PPO活性在贮藏的前3天上升达到最大值，随后略有下降，哈茨木霉处理显著提高了PPO活性的上升。POD在果实中参与木质素的合成，PPO能够提高抗菌物质的转化，两者都可提高果实的抗病性。Jiang等人[5]的研究结果表明，茉莉酸甲酯通过提高POD和PPO的活性提高了葡萄果实的抗病性。

3 结论

哈茨木霉处理促进了CHI、GLU、CAT、PPO及POD等抗性相关酶活性的提高，这是哈茨木霉抑制鸭梨果实采后青霉病的重要作用机理，可以有效抑制青霉菌在鸭梨果实上的发病率和病斑直径。

参考文献

[1]井一诺，王雷.β-氨基丁酸抑制鸭梨果实采后青霉病的机理研究[J].食品研究与开发，2017，38（12）：169–174.

[2]王男麒，黄建国，彭良志，等.哈茨木霉发酵液对柑桔采后绿霉病的防治效果研究[J].中国南方果树，2014，43（3）：5–9.

[3]王雷，李华，张华，等.β-氨基丁酸抑制草莓低温贮藏过程中灰霉病的效果及其机理[J].食品科学，2017，38（21）：272–278.

[4]LIU Ruiling，LAI Tongfei，XU Yong，et al. Changes in physiology and quality of Laiyang pear in long time storage[J]. Scientia Horticulturae，2013，150：31–36

[5]Jiang L，Peng J，Wang L，et al. Methyl jasmonate primes defense responses against Botrytis cinerea，and reduces disease development in harvested table grapes[J].Scientia Horticulturae，2015，192：218–223.

[6]Bradford，M.M.. A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle–dye binding.[J].Analytical Biochemistry，1976，72，248–254.

[7]张红印，马龙传，姜松，等.臭氧结合拮抗酵母对草莓采后灰霉病的控制[J].农业工程学报，2009，25（5）：258–263.

（责编：王慧晴）