夏倩倩 赵 晴 孙乐乐 于功奇 杨 青 王广进吴 梅 刘永霞 陈声利 孙勇虎 刘 红 张福仁

毛囊角化病于1889年由Darier首次命名，故又称Darier病(Darier’s disease, DD)，是一种罕见的常染色体显性遗传病，人群发病率在1/30000到1/100000之间[1]。临床表现为覆有油腻性结痂的毛囊性丘疹，有时可伴有恶臭和瘙痒，好发于腹股沟、腋下等皮肤脂溢部位，部分患者也可累积掌跖。DD常在青春期发病，日晒、高温、潮湿可加重病情[2]。1993年Craddock等[3]对英国的DD家系进行连锁分析，首次将该病的致病基因定位于染色体12q23-24.1，1999年Sakuntabhai等[4]将DD致病基因定位于12q23-24.1上编码肌浆/内质网钙离子-ATP酶2(SERCA2)的ATP2A2基因。目前为止，研究者已在不同家系或散发病例中发现了250多种不同的ATP2A2基因突变(http://lovd.nl/ATP2A2)，其突变类型多样，以错义突变最为常见[5]。在本研究中，我们收集了1家系及3例散发DD患者，通过PCR扩增和Sanger直接测序法对ATP2A2基因进行突变检测，并对已报道的ATP2A2基因突变进行了文献回顾。

1 对象与方法

1.1 研究对象 在山东省皮肤病医院皮肤科门诊，收集经临床及组织病理确诊的1家系及3例散发DD患者。

家系1共3代人，患者3例，其中男1例、女2例(图1)。先证者(I1)男，67岁，自16岁开始头、颈、背部及四肢开始出现浅褐色油腻性角化性丘疹，伴痒，夏季严重，皮损渐重，融合成片，因搔抓后出现疣状增生，甚至破溃、渗出,结痂(图2a)。其女(II2)，与先证者临床表现相似(图2b)；其外孙女 (III1)，病情较轻，在颈部、腹部、下肢散见质实小丘疹(图2c)。

散发患者S1：女，53岁；头面部、腋窝、腹部可见暗紫红色丘疹，糜烂、少量渗液(图2d)。散发患者S2：女,32岁；头皮、腋窝、腹股沟、乳房下丛集分布褐色丘疹、表面覆有油腻性痂皮(图2e)。散发患者S3：男，26岁；面颊、颈、躯干部角化性丘疹伴痒(图2f)。

以上6位患者均经组织病理确诊(图2g)：表皮角化过度伴角化不全，棘层松解有腔隙形成，可见绒毛、圆体和谷粒细胞，真皮浅层炎细胞浸润，诊断为毛囊角化病。并按照Burge等[2]制定的标准分为轻、中、重度。

图1 家系图

2a、2b：家系患者I1、II2躯干、上肢、头面部，角化性丘疹，上覆褐色油腻性痂皮，部分融合成疣状斑块，可见破溃,结痂；2c：家系患者III1颈部散见质实小丘疹；2d：散发患者S1腋部浸渍样暗紫红色斑丘疹；2e：散发患者S2胸腹部散在褐色角化性丘疹；2f：散发患者S3：躯干部弥漫分布的褐色角化性丘疹，上覆油腻性痂皮；2g:表皮角化过度伴角化不全，棘层松解有腔隙形成，可见绒毛、圆体和谷粒细胞(HE，×200)

图2患者临床和组织病理

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 提取 本研究经山东省皮肤病性病防治研究所伦理委员会批准，签署知情同意书后，抽取患者及其家属外周血5 mL(其中散发患者家属外周血未取得)，同时采集100名无亲缘关系的正常个体外周血5 mL作为对照，-80℃保存。采用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取基因组DNA，并用全波长紫外/可见光扫描分光光度计ND-8000(Thermo Fisher公司，美国)测定其纯度及含量，将其标化为30 ng/μL的DNA模板。

1.2.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增ATP2A2基因全部外显子及侧翼序列 根据既往报道的文献[6]设计特异性引物18对，交由北京华大基因科技有限公司合成。25 μL PCR反应体系为:PCR taq mix 12.5 μL，dNTP上下游引物各1 μL，DNA模板(30 ng/μL)0.5μL，ddH2O 10 μL。PCR反应条件：预变性94℃ 10 min，变性94℃ 30 s，退火55℃～59℃ 45 s ，延伸72℃ 10 min，共进行35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 DNA测序 PCR产物经醋酸钠-乙醇沉淀法纯化后直接于ABI 3130XL基因分析仪(Applied Biosystems,美国)上进行测序。

1.2.4 突变分析 所有测序结果经NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等数据库进行分析比对，利用SIFT及Polyphen-2软件对基因突变进行功能预测。

2 结果

家系中3例患者均携带同一突变，为ATP2A2基因第380位鸟嘌呤突变为胞嘧啶(c.380 G>A)，导致密码子出现GGC→GAC的改变，使得第127位氨基酸从甘氨酸(G)变为天冬氨酸(D)(p.G127D)(图3a)，家系中非患者及100名正常对照均未发现该突变。

散发病例S1中发现ATP2A2基因第1676位鸟嘌呤突变为胞嘧啶(C.1676G>A)，使第559位密码子由CGA变为CAA，导致精氨酸(R)被谷氨酰胺(Q)替代(p.R559Q)(图3b)；散发病例S2患者ATP2A2基因第2001位发现一同义突变c.2001C>T，密码子GAC被GAT替代，但氨基酸Asp未变化(图3c)；散发病例S3未发现ATP2A2突变。在家系中非患者和100名正常对照中未发现上述突变(3a～f)。

利用Polyphen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu)对非同义突变对蛋白质的影响进行分析，发现p.G127D与p.R559Q的预测值分别为0.973和1，预测表明对蛋白质结构影响均为“probably damaging”。

利用ExAC、TOPMed数据库对该突变检索，结果显示T的基因频率分别为0.00002474、2.38910e-05，检索gnomAD数据库显示在东亚人群中T的基因频率为1.08767e-05。此外，我们利用ASSP(http://wangcomputing.com/assp/)对该突变位点所在序列进行选择性剪接位点预测，结果显示该突变位点对剪接位点无影响。

检索Pubmed和万方数据库自1999年至今发表的有关本病ATP2A2基因突变的文章，发现已有250多种不同的突变被报道，其中在 2009年报道了一例38岁的突尼斯重症DD女性患者，其与本研究中散发患者S1携带相同突变基因c.1676G>A[6]；2010年在一斯洛文尼亚家系中发现同为第559位氨基酸的突变，由于第1675位碱基由胞嘧啶突变为鸟嘌呤(c.1675C>G)，而使精氨酸变为甘氨酸(p.R559G)[7]；2011年意大利人群中在第559位氨基酸上发现一无义突变c.1675C>T(p.G559*)[8]。

3a：家系的5号外显子上存在一新发错义突变c.380G>A(p.G127D)；3b： S1患者13号外显子上存在一错义突变C.1676G>A (p.R559Q)；3c： S2患者14号外显子上存在一同义突变c. 2001C>T (p.D667D)；3d、3e、3f：正常对照序列

图3患者突变检测结果

3 讨论

人类ATP2A2基因长约76 Kb，包含21个外显子,该基因编码SERCA2蛋白，SERCA2将钙离子从胞浆转移至内质网内并对表皮的细胞连接和分化起重要作用[9]。1999年Ruiz-Perez等发现只有该基因编码的SERCA2b亚型在皮肤中高表达，SERCA2b亚型主要由胞质部分的3个结构域:执行元件域(A)、磷酸化域(P)、ATP结合域(N)和11个跨膜蛋白(M1-M11)组成，其中3个结构域在钙离子结合和构型改变方面起重要作用[10]。SERCA2b亚型具有更高的钙离子亲和力，同时其催化周转率更低，当其发生突变时会通过降低钙离子亲和力和加快钙离子周转率来使内质网内的钙离子浓度发生改变，也可通过内质网应激反应引起棘层松解、细胞凋亡，最终导致DD的发生[11]。目前已发现的突变位点分散于整个基因，很少出现相同突变，且基因型和表型的相关性也尚未明确[5，10]。

本研究共发现两个错义突变，在该家系的5号外显子上存在一新发错义突变，即c.380G>A，使其编码的甘氨酸变为天冬氨酸(p.G127D)，该突变位于A结构域，该结构域在钙离子通过SERCA2时起杠杆作用[10]。检索国内外文献在该氨基酸上尚未发现其他突变。散发患者S1的13号外显子上发现一错义突变C.1676G>A，使599位的精氨酸变为谷胺酰胺，即p.R559Q，该突变位于ATP结合域，回顾文献发现，在突尼斯人群中发现相同突变，在斯洛文尼亚和意大利人群中发现同为第559位氨基酸的突变，由此进一步证实了该病不存在种族差异，并推测位于559位的精氨酸为该基因的突变热点。这两种突变均可能导致SERCA2蛋白翻译异常，或表达单倍剂量不足，引起钙离子储备耗尽或内质网中钙离子浓度变化，从而影响到表皮细胞分化、细胞间连接等，最终导致DD的发生[12]。在S2患者14号外显子上发现一同义突变c. 2001C>T，利用ExAC、TOPMed、gnomAD数据库对该突变检索,均显示该突变极为罕见。此外，我们利用ASSP对该突变位点所在序列进行选择性剪接位点预测，结果显示该突变位点对剪接位点无影响，散发患者S3中未发现突变，猜测致病突变位点可能发生在未测序区：如启动子区域、内含子序列或3’非翻译区域[4]。环境、生活习惯等其他因素也可能影响ATP2A2基因的表达，从而影响SERCA2蛋白的功能，另外，该病可能存在其他致病基因。

本家系中三位患者携带相同的突变位点，I1、II2患者的病情均十分严重，只有III1的症状轻微，认为可能与该患儿年龄较小有关。总结存在第559位氨基酸突变的患者的临床表现，其中有3例临床表现为重度、1例为轻度、1例为中度，提示DD病情的严重程度与基因型相关性的复杂性。

总之，本研究共发现2种错义突变，均在国内首次报道，丰富了ATP2A2基因的突变数据，有助于进一步探讨ATP2A2突变和DD之间的关系，进而有助于今后开展DD的遗传咨询和产前诊断。DD临床表型和基因型之间的关系有待进一步研究。