耿玉慧，沙隽伊，王文静，贺祥珂，邴欣，*，余小影，贾敏，4，*

（1.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014；2.山东省产品质量检验研究院，山东济南250012；3.乳山市检验检测中心，山东威海264500；4.山东师范大学食品营养与安全校级重点实验室，山东济南250014）

环境雌激素具有高毒性难降解等特点，已成为威胁人类健康的重要因素之一，其常常被分为生物类雌激素、人工合成类雌激素、天然雌激素以及化学污染物等不同来源的环境雌激素。但环境雌激素检测较为困难，主要是由于其种类繁多且每种存在许多结构类似物。适配体具有特异性高、灵敏度好、易于修饰等优点，可极大的降低结构类似物之间的交叉反应，适用于环境雌激素检测。目前，利用指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）已筛选出多种环境雌激素适配体，并利用这些适配体开发出多种快速检测的新方法，它可为环境雌激素的快速检测提供理论依据，具有良好的发展前景，有助于人们更好的进行检测。

1 环境雌激素

环境雌激素对内源性雌激素有明显的干扰效应，具体表现为它会干扰心血管、神经、免疫等系统的正常功能，并可导致癌症、肥胖以及雄性精子数量减少等疾病[1-2]。由于环境雌激素对整个生态系统具有一定的危害效应，同时这种效应具有极大的广泛性和持久性，因此，环境雌激素的研究与检测已成为各国学者的研究热点。环境雌激素主要类型[3]见表1。

表1 环境雌激素种类及作用Table 1 The type and function of environmental estrogen

目前，化学分析方法和生物试验分析方法是化合物的雌激素活性检测的主要方法。其中化学分析方法中主要包括液相色谱分析法、液相色谱串联质谱法、气相色谱分析法、放射免疫法等[11]。生物分析方法分为体内和体外试验两种[12]，如子宫生长实验、重组基因酵母筛检法等。然而，这些方法均存在一定的不足，化学分析方法花费高，操作复杂，样品易受到不同程度的干扰；生物实验分析法耗时长，不适合大量的化合物的检测且容易在筛选时产生误差[13]。因此，开发具有高灵敏度，且可进行现场快速检测环境雌激素的检测技术显得尤为重要。

2 核酸适配体

2.1 适配体技术

核酸适配体（aptamer）是指通过SELEX 技术在寡核苷酸文库经数轮筛选得到的单链DNA 或RNA 片段[14]，适配体可通过折叠成茎环、发卡、凸环、假结或G-四链体等二维或三维结构与靶标物质进行特异结合[15]。相较于一般的抗体和酶，适配体具有高选择性、高亲和力、高稳定性等优点[16]。适配体技术已经广泛应用于医学、化学及生物学等方面[17]，为食品中存在的生物毒素[18]、金属离子[19]及农兽药残留[20]等污染因子的检测提供了新的方法。

2.2 环境雌激素适配体筛选进展

目前已筛选出适配体的环境雌激素有E2、炔雌醇（ethinylestradiol，EE）、孕酮（progesterone，P4）[21]和 BPA[22]。由于E2 是雌激素受体的最适靶标，对E2 适配体的筛选、检测方法及应用也最多；EE、P4 的研究相对较少，对其适配体筛选也相对较少；BPA 作为重要的化工原料广泛存在于环境中，其与人类生活密切相关，因此对BPA 适配体的研究和应用也较多。

2.2.1 E2、EE 适配体筛选

2007年，Kim 等[23]首次利用 SELEX 技术在 7.2×1014mol 单链DNA 分子文库中筛选出长度为76 mer的E2 核酸适配体，E2 的二级结构模拟图如图1。

图1 76 mer E2 适配体二级结构示意图Fig.1 Secondary structure of 76 mer E2 aptamer

适配体与 E2 间的解离常数（Kd值）为 0.13 μmol/L，并利用最小自由能量算法对该适配体的二级结构进行研究。该团队筛选的E2 适配体被广泛应用于E2的检测领域。

2014年，Alsager 等[24]利用相同的方法筛选出长度为75 mer 的E2 适配体，二级结构模拟图如图2，Kd值为25 nmol/L。为了提高所筛选适配体的亲和力和特异性，2015年，Alsager 等[25]利用圆二色谱法检测到该适配体上的3 个茎环结构，通过切除75 mer 适配体序列两侧多余的核苷酸得到22 mer 和35 mer 适配体，其Kd值分别为14 nmol/L 和11 nmol/L。通过计时库仑分析法等分析发现，与75 mer 适配体相比，去除超多侧翼核苷酸序列的两段短适配体的特异性和选择性大大提高。当将剪切后的适配体应用于纳米金比色法检测E2 时，方法灵敏度可提高约25 倍。

图2 75 mer E2 适配体二级结构示意图Fig.2 Secondary structure of 75 mer E2 aptamer

图3 85 mer E2 适配体二级结构示意图Fig.3 Secondary structure of 85 mer E2 aptamer

为提高适配体的特异性，Vanschoenbeek 等[26]针对E2 上不同功能团，建立了A、B 两个筛选程序，筛选针对不同功能团的适配体，其二级结构图如图3 所示。分别在两个含1015寡核苷酸库中得到了19 条和24 条E2 适配体，Kd值分别在 27 μmol/L～124 μmol/L 和0.9 μmol/L～6.0 μmol/L 之间。所得到的适配体对 E2 的特异性有所提高，但某些适配体对EE 仍存在较强的亲和作用。为获得E2 的高特异性和亲和性适配体，Akki 等[27]随后筛选出两条 85 mer，86 mer 的 E2 适配体和一条EE 适配体，并利用平衡过滤法（equilibrium filter method，EFM）测得适配体的Kd值分别为0.6、0.65 μmol/L 和 0.95 μmol/L。并且测得 E2 适配体对 E2的选择性是EE 的74 倍，EE 适配体对EE 的选择性是E2 的53 倍。本试验结果表明所筛选的适配体具有较高的特异性。

2.2.2 BPA、P4 适配体筛选

2011年，Minjoung 等[22]通过 SELEX 技术在包含1015mol 的寡核苷酸随机文库中，经12 轮循环筛选得到长度为57 mer 的BPA 适配体，二级结构如图4 所示，并且利用Mfold 软件通过最小自由能测定，对适配体#3 和#12-5 的二级结构进行分析。利用溶胶-凝胶芯片进行适配体-BPA 夹心试验，发现#3 能够与BPA形成较好的夹心结构，而#12-5 与BPA 的特异性相互作用相对较弱。适配体#3 的Kd值为8.3 nmol/L，该适配体随后被广泛应用于BPA 检测领域。

图4 BPA 适配体二级结构示意图Fig.4 Secondary structure of BPA aptamer

Jiménez 等[28]在一个 1.8×1015mol 单链 DNA 分子随机文库中经过数轮筛选得到第一条P4 适配体，并通过荧光分析法和电化学阻抗谱测定出其Kd值为17 nmol/L，该P4 的适配体与P4 类似物如E2 和炔诺酮（norethindrone，NET）未发生交叉反应，因此 P4 适配体对P4 具有极高的特异性。

不同环境雌激素的结构式千变万化，因此其与适配体的作用位点不相同，这就导致通过SELEX 技术筛选得的适配体也不尽相同；同种靶标通过改变筛选条件可得到不同的适配体，其长度、序列及二级结构也不尽相同，因此适配体与靶标的亲和力、特异性也不尽相同，这为环境雌激素提供了更多的检测方法。不同环境雌激素的结构式及目前筛选得出的适配体长度、序列等信息见表2。

表2 已筛选的环境雌激素适配体Table 2 The screened environment estrogen adapter

3 基于适配体的环境雌激素检测方法

核酸适配体作为一种新型识别分子，具有较高的选择性、灵敏度，同时它易被修饰，可被广泛应用于分析检测领域。由于其具有较高的特异性，适用于具有较多结构类似物的环境雌激素的检测。其易于合成和修饰的特点，为适配体的广泛应用提供较多的便利，比较常见的基于适配体的检测方法主要包括比色法、荧光法和电化学法。

3.1 纳米金比色法

纳米金粒子具有表面等离子共振特性，其大小、形状和分离距离发生变化时，会导致纳米金粒子发生显著的颜色变化[29]。而适配体可以通过静电作用吸附于纳米金表面，使纳米金粒子在高盐浓度下呈游离状态，溶液为红色；利用这一特性，在加入靶标后，适配体与靶标可以更好的进行特异性结合，从而与纳米金粒子解离，使金纳米粒子失去适配体保护而凝聚变蓝。利用该原理，建立了一种针对E2 的基于适配体纳米金比色的检测方法。

3.1.1 纳米金比色法检测E2

Liu 等[30]将长度为76 mer 的E2 适配体分解为P1（33 mer）、P2（43 mer）两个片段，二级结构见图5 所示。

图5 基于适配体的E2 比色检测原理图Fig.5 Scheme of colorimetric detection method of E2 based on aptamer

希望通过分解以提高比色法的灵敏度。试验表明，分离后，P1+P2 仍保留最初76 mer 适配体的亲和力和特异性，而最低检出限（limit of detection，LOD）则降低到原来的10 倍，为0.1 ng/mL，线性范围为0.1 ng/mL～105 ng/mL。灵敏度的增加可能是由较短序列的适配体与E2 的亲和力升高，与纳米金的亲和力降低引起的。

Alsager 等[25]将75 mer 适配体剪切得到两条22 mer和35 mer 短链适配体，建立了基于适配体的E2 比色法，其原理见图6。

图6 基于剪短适配体的E2 比色检测原理图Fig.6 Scheme of colorimetric detection method of E2 based on truncate aptamer

该团队分别比较了长度为75、35 mer 及22 mer 的适配体对E2 检测的效果，发现75 mer 适配体的LOD为 5 nmol/L，线性范围为 5 nmol/L～400 nmol/L；35 mer、22 mer 适配体均可将LOD 降低到800 pmol/L，但是35 mer 适配体的线性范围为200 nmol/L～800 pmol/L；而22 mer 适配体的线性范围仅为35 mer 适配体的一半。还发现，相比于22 mer 适配体，35 mer 适配体由于保留小部分冗余核苷酸，与纳米金结合后仍能较好从其表面脱离下来与E2 结合。因此，保留部分冗余核苷酸片段，更有利于提高检测的灵敏度。

3.1.2 纳米金比色法检测BPA、P4

纳米金粒子的表面等离子共振特性同样被应用于BPA 和P4 的检测中。Zhang 等[31]设计了纳米金比色法快速检测BPA 方法，该方法LOD 为1.5 nmol/L，线性范围为1.5 nmol/L～500 nmol/L，在自来水和河水样中的加标回收率分别为100.9 %～112.7 %。Du 等[32]设计了基于适配体纳米金比色对P4 快速检测方法。该方法的LOD 为2.6 nmol/L，线性范围为2.6 nmol/L～800 nmol/L，同时以水和尿液做加标回收试验，回收率可达84.4%～118.8%。

3.2 荧光分析法

荧光染料主要包括荧光素和量子点，具有强度高，易于标记，发射波长范围广等特点。将荧光染料及其猝灭基团等修饰到适配体上，根据适配体与靶标的结合与解离所带来的荧光信号变化，实现对靶标的分析。适配体荧光分析法具有操作简单，易于实现自动化，灵敏度高等优点。

3.2.1 荧光分析法检测E2

Huang 等[33]使用钌（Ru）复合物与量子点（QDs）作为荧光探针，实现了对E2 的快速检测，其原理见图7。

图7 免标记E2 荧光适配体传感器原理图Fig.7 Scheme of label-free fluorescent aptasensor for E2 detection

Ru 复合物可以猝灭QDs 的荧光，当体系中存在E2 适配体时，Ru 复合物优先与适配体结合，无法与QDs 结合，从而使荧光恢复；当加入靶标后，适配体与E2 结合从而与Ru 复合物分离，Ru 复合物与QDs 结合后将其荧光猝灭。因此，可根据荧光强度定性、定量分析E2。该方法的LOD 为37 nmol/L，线性范围为0.08 μmol/L～0.4 μmol/L。

而Ni 等[34]建立了利用纳米金粒子作为荧光猝灭剂，罗丹明（RhoB）做荧光指示剂的E2 荧光检测方法，原理见图8，该方法成功提高了检测的灵敏度。当体系中不存在E2 时，适配体将通过吸附于纳米金表面，可使纳米金粒子均匀分散于NaCl 溶液中，从而降低RhoB 的荧光强度；当加入E2 时，适配体与E2 结合，与纳米金分离，纳米金粒子发生聚沉，其对RhoB 荧光强度的抑制作用减弱。因此可通过RhoB 的荧光强度变化检测样品中E2 的含量。该方法的LOD 为0.48 nmol/L，线性范围为 0.48 nmol/L～200 nmol/L，在实际水样中的回收率为94.3%～111.7%。

图8 E2 荧光适配体传感器原理图Fig.8 Scheme of fluorescent aptasensor for E2 detection

3.2.2 荧光分析法检测BPA

Zhu 等[35]利用荧光信号可以被氧化石墨烯（GO）猝灭的原理，设计了一步检测BPA 的荧光方法。首先，将FAM 荧光标记的适配体与不同浓度的BPA 标准液结合，保证体系内荧光强度相同；当加入GO 后，GO 可以与未结合的适配体结合，并猝灭其荧光，荧光强度与BPA 含量成正比。该方法的LOD 为0.05 ng/mL，线性范围为0.1 ng/mL～10 ng/mL，以水做加标回收试验，回收率为96.0%～104.5%。而Li 等[36]则建立了另一种方法BPA 的荧光检测方法：他们以纳米金颗粒作量子点荧光猝灭剂，该方法依据适配体与BPA 结合时会改变纳米金颗粒的凝聚状态，从而改变量子点的荧光强度，根据荧光强度进而计算出样品中BPA 的含量。该方法的LOD 为1.86 ng/mL，线性范围为10 ng/mL～80 ng/mL，以自来水为实际样品做加标回收实验也得到了满意的回收率。

3.3 电化学分析法

电化学法是指先将适配体固定于电极上，当适配体与待测物结合后，改变电极上的化学反应，从而改变电极的电化学信号。因此，可通过测定电极的电位、电势、电流等的变化检测待测物的浓度。

3.3.1 电化学法检测E2

Kim 等[23]建立了基于适配体的电化学传感器检测方法来检测E2，方法原理为将适配体固定于被修饰的金电极上，E2 与适配体的结合导致电极化学反应发生改变，从而引起电流大小的改变，通过检测电流来测定样品中E2 的含量，该检测方法的线性范围为0.01 nmol/L～1.00 nmol/L。为提高检测的灵敏度与特异性，Huang 等[37]利用硫化铜纳米片和金纳米粒子修饰玻碳电极及酶信号放大技术，通过伏安法检测电压的变化实现了对E2 特异性检测。该方法的LOD为0.06 pmol/L，检测范围为 0.5 nmol/L～5.0 nmol/L。在实际样品尿液中的加标回收率为96.%～104.3%。基于相同的原理，Zhu 等[38]通过使用长度为75 mer E2适配体设计了E2 的高灵敏检测方法，该方法LOD 为1 fmol/L，线性范围可达 10 ng/mL～60 ng/mL，在自来水中也得到了良好的回收率。为进一步提高分析性能，Povedano 等[39]于2017年将GO 纳米复合材料修饰玻碳电极，戊二醛与漆酶在此纳米复合物上进行交联从而改变电极的电化学信号，基于此原理建立了一种对E2 的快速检测的方法。该方法的LOD 为0.54 pmol/L，线性范围为0.9 pmol/L～11 pmol/L，在动物或合成尿液中的回收率分别为98.8%～100.4%和98.3%～99.5%。

3.3.2 电化学法检测BPA

Liu 等[40]设计了基于双信号放大的电化学法快速检测BPA。首先，将纳米金固定于玻碳电极上，适配体与纳米金结合从而固定于电极上，然后与生物素修饰的互补DNA 探针杂交，形成双链DNA。当体系中含有BPA 时，由于适配体与BPA 特异性结合，与互补链分离，使BPA 被固定在传感界面上，从而改变电化学信号。该方法的LOD 为0.41 pmol/L，线性范围为0.001 nmol/L～1.000 nmol/L，且此方法对 BPA 的选择性良好。Zhang 等[41]于2017年设计了基于金纳米调节电路原理设计了快速检测BPA 的方法。该方法的LOD为 1.5 ng/mL，线性范围为4.4 ng/mL～66 ng/mL，以水为标准样品做加标回收试验回收率为95.4%～106.8%。

3.3.3 电化学法检测P4

Jiménez 等[28]利用其所筛选的 P4 适配体，设计了基于适配体的电化学传感器检测P4 的方法，该方法的 LOD 为 0.9 ng/mL，线性范围为 10 ng/mL～60 ng/mL，以自来水为标准样品的加标试验有较好的回收率。

科学研究是一个不断发展、进步的过程，通过不断改进环境雌激素检测的方法和条件，从而不断提高方法的灵敏度和检出限。核酸适配体作为一种具有高灵敏度和特异性的分子识别探针，将受到越来越多科研工作者的青睐。目前，环境雌激素种类很多，但基于适配体技术对 E2 和 BPA 的检测、报道最多，EE、P4 的检测方法相对较少，还有大量未筛选出的适配体的环境雌激素仍需要人们进一步的努力。已筛选得到适配体的环境雌激素的检测方法、检出限、线性范围等信息见表3。

表3 部分环境雌激素检测方法与结果Table 3 Some environmental estrogen detection methods and results

4 总结与展望

环境雌激素对于人体甚至环境的恶劣影响，它的研究与检测已成为各国学者的研究热点，而环境雌激素通常以极低的浓度出现，需要建立高灵敏度的分析方法。由于适配体与靶标物质有较好的结合力，较高的特异性，抗干扰性强，逐渐出现在人们的视野中，并已经成功建立了如比色法、荧光分析法以及电化学法等等，这些方法较传统的高效液相色谱法，气相色谱法等等有操作简单，经济实惠，用时较短等优点。虽然利用适配体进行环境雌激素的检测还有一定的局限性，暂时还不能完全代替常规的仪器检测方法，但是因为它可以现场快速检测出结果，所以有广阔的应用前景一定的发展空间。