许思齐，金敏

（1.山东农业大学生命科学学院，山东泰安271018；2.山东农业大学农学院，山东泰安271018）

食物中的微生物病原体导致的食源性疾病，对人类的健康造成了严重的威胁。随着疫苗和抗生素的发展与应用，早期的疾病虽可以得到治愈，但新型的与耐药性的病原体仍不断涌现[1]。此外，目前致病菌的诊断方法效率低，速度慢，特别是在资源有限的地区，仍然难以找到合适的解决办法。因此，需要发展更快速，准确，多元化的诊断方法，且不需要复杂的检测步骤和昂贵的分析仪器。以培养为基础的传统分析方法，即“金标准方法”，本质上耗时耗力，且因致病菌侵袭范围的扩大而愈加复杂。这也导致以培养为基础的致病菌检测系统的灵敏度显著降低[2]。因此，研发具有多路复用、灵敏度高、特异性好和成本低等特点的致病菌诊断系统是今后研究的重点。

基于纳米技术的生物传感器与传统检测方法相比具有许多优势，包括高通量筛选、无标记检测、实时分析、低检测限（limit of detection，LOD）和低样本量等特征。随着纳米生物技术的发展和进步，各种类型的结合受体与配体，理化方法和纳米技术已经被广泛应用于生物传感器的开发，为提高致病菌检测性能提供了新思路。目前已经开发出了基于电子[3]，电化学[4]，机械[5]，核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）[6]和光学传感[7]等技术的各种致病菌检测生物传感器。其中，可视化光学生物传感器，特别是比色传感器，更加易于使用，且检测效率高，便携，成本低。此外，光学生物传感器中的等离子体生物传感器具有优异的灵敏度和复用能力。这些独特的优势已经使光学传感器商品化步伐不断加快。

近年来，在致病菌检测领域的一个重要发展趋势是开发用于现场即时检测的可视化生物传感器。随着微流控和光学一体化技术的不断发展，开发现场即时检测系统变得更加可行。此外，前人已对基于智能手机系统研发的既有光源又有光检测器的生物传感器研究开发多年，既可以提供简单使用界面又可以实现快速检测。它不仅为发展中国家提供更加简便、廉价和高效的诊断系统，还能应用于医疗保健、食品安全和环境监测等方面[8]。因此，相信可视化光学传感器在未来的致病菌诊断和现场即时护理点（point-of-care，POC）监测中必定会占据更加重要的地位。

1 比色光学生物传感器

比色生物传感器是一种极具吸引力的光学生物传感器系统，因为人们可以轻松地通过反应液颜色的变化，无需任何分析仪器，即时地用肉眼观察到样品中致病微生物。比色生物传感器通常分为基于平板和溶液的两种表现形式。基于纸张和玻璃的平板形式的传感器由于其操作简单和分析样品量小而更加受到青睐。作为具有代表性的产品，以侧流层析检测（lateral flow assay，LFA）为基础的生物传感器目前在市场上非常普遍。例如，杜邦公司生产的基于LFA 的生物传感器，金标检测卡可以在10 min 内通过特异性抗体检测大肠杆菌O157：H7、沙门氏菌和李斯特菌。生物梅里埃公司设计的产品可在15 min 内检测出链球菌和嗜肺军团菌。这些产品都是利用了样品在滤纸或膜中因毛细作用流动扩散以及通过金纳米颗粒（gold nanoparticles，Au NPs）聚集而产生颜色的变化。

然而，基于LFA 的生物传感器主要存在的缺点是灵敏度较低[9]。目前较为常用的方法是通过放大信号来提高灵敏度，例如，Hossain 等[10]使用磁珠预浓缩菌体细胞。此方法是将受体附着在磁珠上，从磁铁样品中分离出目标致病菌细胞，使分离的细胞通过重新悬浮在任何所需检测的体积中而实现易于浓缩的目的。该方法可使细胞浓缩10 倍～100 倍，从而能够在30 min内诊断出检测限为5 CFU/mL 的大肠杆菌O157：H7，如图1 所示。

图1 基于LFA 的比色传感器[10]Fig.1 The colorimetric biosensor based on the LFA[10]

Hadi 等[11]提出一种基于磁珠聚合且与手机摄像头相连的生物传感器。利用该传感器系统，不仅能够用肉眼检测出样品中的大肠杆菌，还能在计算机上使用手机摄像机和数字成像分析软件进行半定量分析，LOD 值可低至8 CFU/mL。基于LFA 的传感器的另一个局限性是多重检测的能力受限[12]。若想在一个单一的平板基片上进行多重分析检测，需要研究人员积极研发新型的制造工艺来固定特异的受体。此外，还有多种制作方法，包括光刻、喷墨印刷、等离子蚀刻和蜡印刷等[13-15]。这些制作工艺通过在亲水性多孔纸基中创建物理或疏水的通道屏障，制作出多种的2D 或3D分析检测装置[16]。基于折纸的制作方法可形成多个微斑点和图层，其具有不同的模式，因每层的吸液率不同，从而实现对分析物进行多重分析与半定量测定[17]。

另一种形式是基于溶液体系比色生物传感器。Tram 等[18]提出了一种简单而成本低廉的细菌检测方法，见图2。该方法利用细菌特异性RNA 切割DNA 酶探针作为分子识别元件，利用脲酶水解尿素来提高检测液的pH 值，通过将脲酶与磁珠上的DNA 酶偶联，将细菌的检测转化为pH 值的增加，更易于随后的石蕊染料或pH 值试纸的比色检测，虽然该方法操作简单，价格低廉，但灵敏度较低（5×102CFU/mL，1 h 和 5×103CFU/mL，2 h），因此如何提高灵敏度是比色生物传感器检测致病菌的关键点。

图2 基于溶液体系的比色传感器[18]Fig.2 The colorimetric biosensor based onsolution system[18]

2 等离子体光学生物传感器

近年来在致病菌检测的发展及应用中，等离子体生物传感器由于灵敏度和特异性高以及仪器和操作的简易性发展势头迅猛。其中最主要的两类等离子体生物传感器是表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）和表面增强拉曼光谱（surface-enhanced raman scattering，SERS）[18-19]。

SPR 传感器因其穿透金属表面的深度有限，及细菌细胞质与水介质折射率相似，限制了其检测较大体积的物体（如整个微生物细胞），通常灵敏度较低（LOD约为1.0×103CFU/mL）。经过前人的不断探索，目前SPR 生物传感器的灵敏度已经明显提高。Torun 等[20]提出一种结合磁性纳米颗粒的SPR 传感器进行磁分离的检测大肠杆菌的方法，最检测限可低至3 CFU/mL。Yoo 等[21]应用局部表面等离子体共振（localized surface plasmon resonance，LSPR）对金纳米颗粒（gold nanoparticles，Au NPs）结构进行修饰从而实现单一传感器同时识别3 种不同的致病菌的突破，检测限（limit of detection，LOD）为 30 CFU/mL。Kim 等[22]开发了一种用 Cu代替Au 作为外壳材料，并由核心结构表面有序排列二氧化硅纳米颗粒制作而成的LSPR 传感器，且超灵敏地检测到LOD 为10 fM 的致病菌的DNA，其原理图如图3 所示。

图3 基于SPR 的传感器[22]Fig.2 The plasmonic biosensor based on the SPR[22]

表面增强拉曼光谱（surface-enhanced raman scattering，SERS）因其灵敏度可达到单分子水平，特异性好以及对淬火不敏感性已广泛用于致病菌检测方面的研究[18]。目前大多数表面增强拉曼光谱（surface-enhanced raman scattering，SERS）生物传感器都需要体积庞大的光学元件，如光学显微镜、激光器、单色仪和探测器等。因此，今后的研究应着力于开发简单小型化的表面增强拉曼光谱（surface-enhanced raman scattering，SERS）生物传感器。SERS 生物传感器的另一个局限性是样品中致病菌的定量检测。这取决于SERS 的性质，即拉曼信号的增强程度取决于金属表面的纳米级尺寸的粗糙度。Kang 等[23]研制了一种可作为特异且灵敏的多通路DNA 传感器的金颗粒在线系统。由多个金纳米线传感器形成的图案为每个传感器提供相应的位置与标识。利用该系统，可以定量检测目标DNA，检测限为10 pM。该传感器系统成功地识别了参考致病菌与临床分离物中的目标物DNA，为传染病的诊断提供了依据。Kearns 等[24]利用磁分离和SERS 技术，研制了一种分离和检测多种致病菌的新型生物传感器。这种新的检测方法涉及到使用凝集素功能化磁性纳米颗粒从样品基质中捕获和分离细菌，然后使用SERS 活性纳米颗粒特异性地检测细菌病原体，其原理如图4 所示。

图4 基于SERS 的传感器[24]Fig.4 The plasmonic biosensor based on the SERS[24]

此研究可检测3 种致病菌单一和混合的样品——大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，每种细菌的最低检测限可达101 CFU/mL。这为未来的致病菌多重检测的研究与发展提供了理论依据。致病微生物还可通过层次聚类分析来进行识别。聚类分析是利用了细菌细胞壁的组成成分（多糖，蛋白质，脂质，核酸等）来显示不同的SERS 谱的特征。因此，病原微生物不同的细胞壁成分使其SERS 光谱“特征”表现不同。但因对分析软件和致病菌标准的表面增强拉曼光谱（surface-enhanced raman scattering，SERS）数据库有较高要求，SERS 生物传感器应用于致病菌的检测仍然任重而道远。

3 微流体光学生物传感器

近年来，微流控技术的快速发展，使其被广泛应用于各种光学生物传感器中用以检测致病微生物。生物传感器与微流体集成的检测系统能够在单一设备上进行样品的添加、分离、制备和分析，其具有成本低、检测时间短、多通量、自动化、便携性，多功能性和所需样品量小等多种优点[25]。从复杂样品中有效分离致病菌对于精确检测病原体至关重要，同样也是今后疾病控制和食品、环境监控的需求。近年来，研究人员对集成光学生物传感器越加重视。例如Lee 等[26]研发了一种利用磁性纳米粒子组（magnetite nano clusters，MNCs）和三维印刷螺旋微通道装置来检测大肠杆菌的分析方法。用抗体功能化的磁性纳米粒子组（magnetite nano clusters，MNCs）捕获牛奶中的大肠杆菌，使用永久磁铁将游离的MNCs 和MNC-菌体复合物从牛奶中分离出来，然后将该溶液注入螺旋微通道装置中，通过分光光度法测定大肠杆菌的浓度，该方法缓冲液中检测限为101CFU/mL，牛奶中检测限为102CFU/mL。三维印刷螺旋微通道传感器见图5。

图5 三维印刷螺旋微通道传感器[26]Fig.5 The 3D-printed microfluidic biosensor device[26]

此外，科研工作者也努力研发自动化与微型化的生物传感器检测系统。例如，Ramalingam 等[27]开发的能够在微流控芯片中对聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）进行耦合的荧光传感器能够实时检测各种病原体的DNA，如图6 所示。

图6 荧光微流控芯片传感器[27]Fig.6 Fluorescence microfluidic chip biosensor[27]

高精确控制温度是微流控PCR 的一个重要研究课题，并且最近开发了基于微流体的等温循环PCR 装置，如核酸序列依赖性扩增技术（nuclear acid sequence-based amplification，NASBA）和环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification method，LAMP）[28-29]。在某些情况下，微流控装置会被设计成多隔板式结构，用于多重检测不同的致病微生物。Foudeh 等[30]研发了一种针对嗜肺军团菌的快速、高特异性和灵敏性的检测方法，主要是由于基因的16S rRNA二级结构，通过核糖体碎片和量子点增强检测信号，增加了检测系统的灵敏度。此方法可以检测菌体16S rRNA 基因溶液浓度为102pM，体系为45 002 μL 的样品，可直接、即时、有效地检测人工水系统中的嗜肺军团菌。目前，越来越多的研究者将无线网络粘合剂装置组装在结构化的电子微流控基底上来监测生物传感器的检测结果，并将数据实时传输到手机或计算机系统[31]。各种用于检测致病菌的光学生物传感器的研究实例见表1，各种用于检测致病菌的光学生物传感器的优缺点及改进措施见表2。

表1 各种用于检测致病菌的光学生物传感器的研究实例Table 1 Research examples of various optical biosensors for the detection of pathogenic bacteria

续表1 各种用于检测致病菌的光学生物传感器的研究实例Continue table 1 Research examples of various optical biosensors for the detection of pathogenic bacteria

表2 各种用于检测致病菌的光学生物传感器的优缺点及改进措施Table 2 Pros cons and improvement of various optical biosensors for detection of pathogenic bacteria

4 结论

目前，用于致病菌检测的可视化集成光学生物传感器已得到极大的发展，展现出广阔的应用前景，同时也存在一些尚未解决的问题。在高通量模式下应用于大量临床和环境样本的致病菌检测光学生物传感器方面的文献较少。此外，致病微生物的多样性，使检测系统难以有效地覆盖全部目标物。因此，开发高效的检测系统是致病菌检测与诊断发展的重要方向，需要科研人员不断地探索与光学生物传感器系统有关的各种新方法、新策略。例如，将已有的检测方法与分析设备结合开发出更为先进的诊断设备，提高其灵敏度与特异性，尤其是无线通信集成的光学生物传感器在致病菌诊断系统应用方面的前景非常可观。基于新型纳米技术的光学生物传感器正推动致病菌的检测设备趋向于小型化、简单化、成本低廉、高通量和集成多元化发展。凭借可视化光学生物传感器的诸多优势，这类传感器必定会在临床研究、食品安全、环境监测、病理分析、法医鉴定等领域发挥巨大的应用价值并在现场即时检测系统中占有具有极其重要的地位。