刘袆帆，梁嘉熹，王琴

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510000）

金柚栽培历史悠久，品种众多，产量高，目前在广东梅州等地大量种植[1]。柚皮是柚子食用和加工过程中的主要副产物，占单果质量的40%～50%，但目前加工方法除柚皮果脯外，大部分柚皮被废弃，造成资源的极大浪费。柚皮含果胶、黄酮、萜类等多种生物活性成分。柚子皮和囊衣中较多存在天然的一种植物黄酮——柚皮苷[2]，它是一种双氢黄酮类化合物[3]。据文献报道，柚皮苷具有多种生物活性，包括抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抑菌、改善微循环、降低毛细血管的脆性等[4]。董媛琪等[5]指出，柚皮苷对自由基具有一定的清除作用。Tian 等[6]利用柚子皮醇溶液发酵提高黄酮含量，指出黄酮化合物变化与抗氧化能力相一致。Guo等[7]从4 种柑橘类植物中测定黄酮含量，发现奉节脐橙浆黄酮类化合物含量最高，综合抗氧化活性高，活性氧清除能力强。目前，柚皮苷在医药、食品及化妆品等领域具有广泛的应用[2]，可作为天然色素、风味改良剂和苦味剂等在食品中用于生产[8]，也可作为合成高甜度、无毒性、能量较低的新型甜味剂的二氢柚苷查耳酮的原料。

柚皮苷的传统提取方法为热水提取法，碱提酸沉法，有机溶剂提取法，另外，还有超声波辅助提取，微波辅助提取，超临界二氧化碳提取等高新技术。常规传统的提取法效率较低，溶剂耗费比较多，提取比较耗时[9]。陈源等[10]以葡萄柚为原料，采用微波辅助提取技术，发现其中柚皮苷的提取率为5.94%。洪晓婷等[11]利用超声波辅助技术提取沙田柚皮的柚皮苷，其含量达33.8 mg/g。陈欲云等[12]通过响应面法优化沙田柚皮柚皮苷的提取条件，该提取率达6%。采用超声波辅助提取，优点在于提高介质的穿透力和增大分子的运动速度，从而提高产品得率，减少溶剂的消耗，提高提取的效率，降低成本，适应范围比较广[13]。因此，综合以上优点，超声波辅助提取能为试验提供高效、便捷的方法。

本研究采用超声波辅助浸提技术，优化提取金柚柚皮中的柚皮苷，首先采用单因素与响应面分析确定柚皮中柚皮苷提取的最优工艺条件，随后通过比对柚皮苷提取物的体外抗氧化活性，包括1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除力，2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]自由基清除能力，Fe3+还原力；同时选用经2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（2，2'-azobis-2-methyl-propanimidamide，AAPH）自由基诱导的红细胞溶血模型，来评估金柚柚皮中柚皮苷提取物的抗氧化能力，为金柚柚皮的综合利用的开发寻找有效途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金柚柚子：采购于深圳百果园实业发展有限公司；柚皮苷标准品、一缩二乙二醇、氢氧化钠、磷酸缓冲溶液、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、抗坏血酸、DPPH、ABTS、过硫酸钾、无水乙醇、AAPH：均为分析纯，广州齐云生物技术公司。红细胞来源于3 位志愿者血液。

1.2 仪器与设备

800Y 型高速粉碎机：安阳市博宇医疗器械有限公司；DHG-9013A 型恒温烘箱：上海善志有限公司；SLSM 型超声-波微波反应系统：天津先欧公司；HH-1 型恒温水浴锅：山东东易日盛仪器有限公司；SPECORD50型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 柚皮苷提取

将金柚柚皮洗净，沥水，取外皮，去除外皮黑点以及损伤部分，剪碎成1 cm2左右，烘干约12 h 至恒重，柚皮要求呈干硬无疏松状。粉碎机研磨5 min，过80 目筛，得柚皮粉，密封，放干燥器备用，精确称取。称取适量的柚皮粉，置于超声波提取容器中，加入一定体积乙醇溶液，设定超声功率及时间，超声提取操作后取出，使用抽滤机抽滤，弃滤渣，待用。

1.3.2 柚皮苷提取物含量测定

本试验采取戴维斯法[14]测定柚皮中的柚皮苷提取物含量。吸取待用滤液样品0.1mL于10mL比色皿中，依次加入体积分数为90%的一缩二乙二醇溶液5 mL和4 mol/L NaOH 溶液0.1 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，40 ℃水浴10 min，冷却后，以空白对照作参比，于420 nm 检测反应液吸光度，记录并计算样品液浓度。

1.3.3 标准曲线制作

精确称量5.0 mg 的柚皮苷标准品，用无水乙醇定容至50 mL，得到0.10 mg/mL 的柚皮苷对照品标准液[11]，依次精密地称取0.10mg/mL 的柚皮苷对照品标准0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5mL于 10mL的比色管中，依次加入体积分数为90%的一缩二乙二醇5 mL和4 mol/LNaOH 0.1mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，40 ℃水浴10 min，冷却后以空白液作参比，于420 nm 检测反应液吸光度，以浓度作为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，以计算柚皮苷提取物含量。

1.3.4 柚皮苷提取量的计算

将测定的样品测出的吸光值对照标准曲线，计算出对应浓度。

式中：C 表示样品液浓度，mg/mL；V 表示溶剂体积，mL；M 表示柚皮粉质量，mg。

1.3.5 柚皮苷提取物单因素试验研究

选取不同的提取时间、料液比、超声波功率作为提取率的影响因素进行单因素试验。

料液比的影响：设定提取时间为30 min，超声波功率为 500 W，1∶16、1∶20、1∶24、1∶26、1∶28（g/mL）的料液比考察对提取率的影响，重复3 次试验，取平均值。

提取时间的影响：设定超声波功率为500 W，料液比为 1∶20（g/mL），40、50、60、70、80 min 的提取时间考察对提取率的影响，重复3 次试验，取平均值。

超声功率的影响：设定提取时间为30 min，料液比为 1∶20（g/mL），以 300、400、500、600、700 W 的超声功率考察对提取率的影响，重复3 次试验，取平均值。

1.3.6 响应面法分析优化柚皮苷提取物提取工艺

在3 个单因素研究基础上，选定三因素三水平运用Design-Expert8.0 的方法，以柚皮苷提取物含量作为响应值进行响应面分析，筛选出最佳提取工艺。

1.3.7 抗氧化活性的测定

1.3.7.1 DPPH 自由基清除能力

取1mL样品液，加上4mL的0.12 mmol/L DPPH溶液，混合均匀，避光反应30 min，离心10 min，用95%乙醇作参比，在517 nm 下测量吸光度A1，无水乙醇吸光值为A2，用相同体积的样品溶剂代替样品溶液作为对照，吸光值为A0[15]。同时用相同浓度的VC作为控制对照组，计算清除率。

式中：A1为样品测定吸光值；A2为无水乙醇吸光值；A0为相同体积的样品溶剂代替样品溶液作为对照吸光值。

1.3.7.2 ABTS+自由基清除能力

5mL7mmol/L 的 ABTS 溶液和 5mL2.45 mmol/L的K2S2O8溶液避光反应12 h 生成ABTS+使用液，该使用液提前一天配制，且必须当天使用，使用前用无水乙醇稀释到吸光值在732 nm 处为0.70±0.02。取0.4mL不同浓度的样品溶液于试管中，加入3mLABTS+使用液，室温（25 ℃）下避光反应 30 min，于 732 nm 处测定吸光值A1，无水乙醇代替ABTS+使用液扣除样品溶液的本底吸收，吸光值为A2，用相同体积的样品溶剂代替样品溶液作为对照，吸光值为A0[16]。同时用相同浓度的VC作为控制对照组，计算清除率。

式中：A1为样品测定吸光值；A2为无水乙醇代替ABTS+使用液扣除样品溶液的本底吸光值；A0为相同体积的样品溶剂代替样品溶液作为对照吸光值。

1.3.7.3 铁离子还原力

样品液1 mL，加上0.2 mol/L 磷酸缓冲液和1%铁氰化钾各2.5 mL，混合后在50 ℃20 min，冷却后加体积分数为10%三氯乙酸2.5 mL，混匀，离心，10 min 后取2.5mL试液，加2.5mL水，1mL体积分数为0.1%FeCl3，10 min 后在 700 nm 处测吸光值，以相同浓度的VC为对照。

1.3.8 红细胞溶血试验

取1.5mL的红细胞悬液于2mL的离心管中，在4 ℃条件下1 200 r/min 离心5 min，去除上清液，加入1.5mL的磷酸缓冲溶液将红细胞重悬后再次进行离心，该步骤重复3 次，以除去红细胞悬液中的细胞碎片，得到结构完整的红细胞沉淀，将沉淀红细胞用PBS配制成体积比为6%的红细胞悬液备用。取6%的红细胞悬液0.2mL分别加入3 支5mL的离心管中，第一支离心管中加入0.2mL样品，第二支试管中加入0.2mL样品，第三支试管中加入0.2mLPBS（pH 值为7.4），置于37 ℃摇床中，避光缓慢震荡30 min，第一支离心管中加入0.4 mLAAPH，第二支试管中加入0.4mLPBS（pH 值为 7.4），第三支试管中加入 0.4mLAAPH，置于37 ℃摇床中，避光缓慢震荡2 h，在3 支离心管中加入3.2mL的 PBS（pH 值为 7.4），在 4 ℃条件下 1 2 00 r/min离心10 min，取上清液测定540 nm 处的吸光值，记为A。取6%的红细胞悬液0.2mL加入5mL的离心管中，加入3.8mL的超纯水，置于37 ℃摇床中，避光缓慢震荡 2.5 h，在 4 ℃条件下 1 200 r/min 离心 10 min，取上清液测定540 nm 处的吸光值，记为B[17-18]。

式中：A 为样品吸光值；B 为空白对照组吸光值。

1.4 数据统计与分析

所有试验均做3 次平行，结果以平均值±标准方差表示。采用SPSS17.0 统计软件单因素方差分析和Tukey's multiple range test 进行显著性分析（p＜0.05 表示差异显著）。

2 结果与分析

2.1 标准曲线制作结果

经过对有关数据进行记录和分析，标准曲线如图1 所示。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curve

柚皮苷标准品的吸光值与浓度的线性回归方程式是y=25.002x-0.004 5，y 轴为吸光值，x 轴为柚皮苷标准品浓度mg/mL，相关关系为系数为R2=0.999 3，表明线性关系良好，柚皮苷提取物含量测定能根据此曲线计算得到。

2.2 单因素结果分析

2.2.1 料液比的影响

料液比对柚皮苷提取率影响如图2 所示。

图2 料液比对柚皮苷提取物提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of naringin extraction

根据溶剂的种类和用量不同会影响溶剂自身极性，溶出成分对组织作用影响与溶剂极性有关。不同料液比对柚皮苷提取物有明显差异。在同一时间，同一超声功率下，不同的料液比呈先缓慢增加，后逐渐减少趋势。当料液比为1∶26（g/mL）时达到峰值，提取率为 2.4%。因此，1∶26（g/mL）为最佳料液比。

2.2.2 提取时间的影响

提取时间对柚皮苷提取率的影响见图3。

图3 时间对柚皮苷提取物提取率的影响Fig.3 Effect of time on extraction rate of naringin extraction

根据图3 所示，提取时间为横坐标，提取率为纵坐标。其他条件控制不变下，在40 min～50 min 时曲线趋势稍缓慢，在超声波系统中充分浸渍下，在50 min～60 min 时曲线趋势增长显著，在70 min 时达到峰值，提取率为2.5%。经分析认为，超声波伴随能量，随着时间越长，组织作用大，其他成分含量变化较多，积累的能量会影响柚皮苷提取物溶出。故将提取时间设置为70 min 最合适。

2.2.3 超声功率的影响

功率对柚皮苷提取率的影响见图4。

图4 功率对柚皮苷提取率的影响Fig.4 Effect of power on extraction rate of naringin extraction

由图4 可看出，在其他条件不变下，超声功率变化明显，在功率为300 W～600 W 时提取率显著上升。在功率为600 W 达到峰值，峰值时，提取率为2.6%。提取过程中由于超声波的机械作用，空化作用引起的强烈震动，使得细胞壁被击破，有利于有效成分的溶出。当功率增大时，由于震动作用多于强烈，溶解的杂质也随即增加，影响提取率[19]。因此，超声波功率设置为600 W 最合适。

2.3 响应面结果分析

2.3.1 响应面因素选取及方法

综合上述单因素试验结果，根据Box-Benhnken的中心组合设计原理，选定提取功率，料液比，提取时间3 个因素作为响应面分析试验因素，采用三因素三水平响应面分析方法，利用Design-Expert8.0 软件对数据进行拟合优化柚皮苷提取物的提取工艺。设计试验的水平及因素如表1 所示。

表1 设计试验的水平及因素Table 1 Level and factors of design experiment

以A、B、C 为自变量，以柚皮苷提取物提取率为响应值（Y），试验方案如下表2。其中，1 号～12 号试验为析因试验，13 号～15 号为中心试验。

表2 响应面试验方案Table 2 Response surface experimental scheme

2.3.2 二次方程模型建立

根据响应面分析试验的结果，运用Design-Expert8.0 软件进性回归拟合分析得到各提取条件和柚皮苷提取物提取率之间的二次多项式方程模型为：

Y=3.33+0.22A+0.07B-0.16C+0.10AB+0.08AC-0.02BC-0.71A2-0.22B2+0.28C2

该方程各项系数的绝对值大小直接反应各因素对响应值的影响程度[20]。由方程一次项系数可知，影响柚皮苷提取物的提取量的因素为A＞C＞B。显然，影响因素主要是提取时间，其次是料液比，最后是超声波功率。

2.3.3 方差分析及结果

运用响应面分析法对响应面的结果分析和所建立的数学模型进行方差分析，试验结果如下表3 所示。

表3 响应面的结果分析Table 3 Result analysis of response surface

根据上表中的分析结果可知，整体模型p 值为0.011 9，模型为显著。因受各实际条件，原材料影响，各试验号存在误差。在此情况下，R2=0.944 1，体现理论预测值和试验测定值具有很好的相关性。Adjusted R2=0.843 4 说明该模型适合用来进行柚皮苷提取物提取率的响应值的预测。在各因素中，一次项A，二次项A2对提取效果有很大影响，而一次项B 和C 显著性不高，交互项AB，AC 和BC 并不显著。

2.3.4 等高线和响应面图

根据响应面值的各因素影响下，能得出一个通过模型的所展示的三维结构图。对比AC 和BC 的交互作用，AB 之间因素交互效果最好，因此针对AB 之间的因素做出分析。时间A 与功率B 交互作用影响提取率的响应面图见图5。

图5 时间与功率交互作用影响提取率的响应面图Fig.5 Response surface for the effects of time and ultrasonic power on the naringin extraction

在图5 中，能直观地反应各因素对于提取率的影响，能找出最佳参数，并能预测和检验变量的响应值，可辅助判断各变量间的相互作用。曲线越陡，反映出响应值在此操作条件下越敏感，若相对平滑，则反之。从图5 中可看出时间曲线相对陡峭，时间的p 值也达到相对显著的水平。

时间与功率响应面分析等高线图见图6。

图6 时间与功率响应面分析等高线图Fig.6 Contour plots for the effects of time and ultrasonic power on the naringin extraction

等高线的中心点为响应面值的最高值，随时间变化先上升后下降，随功率增加，也是先上升后下降，在约71 min，600 W 超声波功率的到极值。等高线的形状也可以看出时间和功率两因素之间交互关系，等高线呈椭圆形，证明这两因素间交互效果佳。

2.3.5 验证性试验及结果

响应面图成山丘型曲面，柚皮苷提取物提取率能得最大值。经分析，获得最佳条件是时间为71.36 min，功率 618.726 W，料液比约为 1∶27.8（g/mL），所预测的柚皮苷提取物提取率为3.803%。由于考虑实际操作与设备条件关系，把条件取相近数值，时间为71 min，功率为600 W，料液比为1∶28（g/mL）。为检验此方法的可靠性，在此条件下进行柚皮苷提取物提取3 次，并取平均值，得出相对准确的结果。根据响应面分析法得到的最佳提取条件，预测提取率为3.803%。所得最佳条件为进行3 次试验结果，试验记录如表4 所示。

表4 验证结果记录Table 4 Verification result records

根据上表所示，所测得的理论值与3 组验证试验的平均值基本符合，误差较小，可靠性高。测定的结果稳定，具有一定实际价值，对于柚皮苷提取物的提取工艺有一定的意义。

2.4 DPPH自由基清除能力

柚皮苷提取物和VC的DPPH 自由基清除能力如图7 所示。

图7 DPPH 自由基清除率Fig.7 DPPH free radical clearance rate

随着VC随浓度变化，清除率相对变化。当柚皮苷提取物浓度为10 μg/mL 时，清除率最高。不同浓度柚皮苷提取物对于DPPH 自由基清除率总体趋势相对平缓。柚皮苷提取物对DPPH 自由基清除能力的IC50值为31.61 mg/mL。由于黄酮化合物中B 环的临位酚羟基是抗氧化性的影响基团，存在B-3′-OH 和B-5′-OH 能使抗氧化活性增加，而柚皮苷中缺少此基团，因此抗氧化效果差于 VC[3，21]。

2.5 ABTS+自由基清除能力

柚皮苷提取物和VC对ABTS+自由基清除能力如图8 所示。

图8 ABTS+自由基清除率Fig.8 ABTS+free radical clearance rate

ABTS+自由基的清除能力随着柚皮苷提取物浓度变化而变化。当柚皮苷提取物浓度在8 μg/mL 时，它对ABTS+自由基的清除能力就达到最大。由图可以看出在浓度范围为 2 μg/mL～6 μg/mL 时，对 ABTS+自由基的清除能力柚皮苷提取物强于VC。当浓度高于8 μg/mL时，柚皮苷提取物的ABTS+自由基清除能力稍弱于VC。柚皮苷提取物对ABTS+自由基清除能力的IC50值为 26.76 μg/mL。

2.6 Fe3+还原能力

还原力越强，抗氧化能力越强[22]。柚皮苷提取物和VC对Fe3+还原能力见图9。

图9 Fe3+还原力Fig.9 Fe3+reducing power

在 2 μg/mL～10 μg/mL 的范围里，柚皮苷提取物的Fe3+还原能力弱于VC。由图可知，Fe3+还原能力随着柚皮苷提取物与VC浓度增大而增大。

2.7 红细胞溶血试验

柚皮苷提取物溶血率如图10。

图10 柚皮苷提取物对AAPH 诱导的红细胞溶血情况Fig.10 Hemolysis of erythrocytes induced by AAPH induced by naringin extract

随着柚皮苷提取物浓度升高，溶血率越低。红细胞溶血率随着柚皮苷提取物浓度降低而降低。由于红细胞结构简单，容易受到自由基侵害体内细胞，从而发生氧化溶血[23]。试验中加入柚皮苷提取物能降低红细胞溶血率，说明在此条件下，柚皮苷提取物具有良好的保护机制。柚皮苷的IC50值为1.819 μg/mL，对于红细胞溶血有一定的作用，具有抗氧化功能。

3 结论

利用响应面分析法对超声波辅助提取金柚柚皮中的柚皮苷提取物工艺条件进行优化。首先，通过单因素的考察，研究提取过程中提取时间，料液比，超声波辅助提取功率对柚皮苷提取物提取率的影响。再根据单因素试验选取影响较大的水平，采用了响应面分析法，并分析各因素的显著性和交互作用及其响应值，筛选出最佳提取工艺。在该过程中，选用紫外分光光度计测定柚皮苷提取物的含量，通过戴维斯法进行显色反应并测定柚皮苷提取物有效成分的含量。在时间为 71 min，功率为 600 W，料液比为 1∶28（g/mL）条件下，测量的柚皮苷提取物提取率为3.8%，与预测的提取率为3.803%相近。证明在此方法中，能通过响应面的方法优化试验条件，从而大大降低提取液的消耗，增加提取效率。

通过柚皮苷提取物对DPPH 自由基清除能力，ABTS+自由基清除能力，Fe3+还原能力，这3 种自由基体系中得出柚皮苷提取物具有抗氧化能力。通过经AAPH 诱导的红细胞溶血模型中，柚皮苷提取物的有一定程度捕获AAPH 自由基的能力，从而保护红细胞，为研究柚皮苷的有效开发具有一定意义。