李好 周武碧

环状RNA（circRNA）是一类通过特殊的环形拼接形成稳定结构的RNA，相较于微小RNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA），circRNA在哺乳动物细胞中具有更高的稳定性和序列保守性。circRNA可以与miRNA结合充当“miRNA海绵”，也可以在转录水平或转录后水平调节基因表达，从而间接调控蛋白表达[1-4]。已有相关文献报道circRNA与肿瘤的发生、发展关系密切[5-10]。有学者通过微阵列分析，首次发现hsa_circ_0016788在肝癌组织中高表达，且能促进肝癌细胞的增殖[11]。目前关于hsa_circ_0016788在结直肠癌中的作用尚未完全清楚，故本研究探讨了结直肠癌组织及癌旁正常组织中hsa_circ_0016788的表达差异，同时分析结直肠癌组织中hsa_circ_0016788表达与患者临床特征的关系及对预后的影响，并采用体外细胞迁移实验验证hsa_circ_0016788与结直肠癌细胞迁移、侵袭能力的关系，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料及细胞系来源 cDNA组织芯片（包含80例结直肠癌组织标本和15例癌旁正常组织标本）购自上海芯超生物科技有限公司，包含了完整的临床资料（如年龄、性别、淋巴结转移、远处转移、TNM分期等）及随访资料，患者手术时间为2006年2月至2010年2月，随访至2015年9月，随访期间病死44例，所有患者术前未予放化疗。4株结直肠癌细胞（HT-29、HCT116、SW480、LOVO）和 1株正常肠上皮细胞（HCO）购自上海中科院生物化学研究所，所有细胞在10%FBS的RPMI 1640培养基中培养，37℃、5%CO2孵育箱中培养。

1.2 hsa_circ_0016788表达水平检测 使用Trizol试剂提取结直肠癌细胞及正常肠上皮细胞RNA，使用2μg RNA逆转录为cDNA；抽提质检cDNA组织芯片肿瘤组织和癌旁正常组织RNA后（由上海芯超生物科技有限公司完成），铺于96孔板上。使用RT-PCR试剂和ABI 7500 PCR仪器检测细胞株和cDNA组织芯片中hsa_circ_0016788表达水平。以甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，测得的hsa_circ_0016788与GAPDH的阈值循环数（Ct）之差为 ΔCt，使用 2-ΔΔCt计算 circRNA的相对表达量；以上实验步骤重复3次，取平均值。引物序列：GAPDH正向5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，反向 5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3′；hsa_circ_0016788 正 向 5′-CAGTTTATGATTGCCGTCCTCC-3′，反向 5′-GTGATCGTCTAGGTGGTAACC-3′。取80例结直肠癌组织中hsa_circ_0016788相对表达量的中位数，＜中位数则定义为hsa_circ_0016788低表达，≥中位数则定义为hsa_circ_0016788高表达。

1.3 细胞转染 3条hsa_circ_0016788的siRNA由上海吉凯基因有限公司合成。将5×105个细胞铺在6孔板中，经过24h，细胞密度达70%～80%。使用lipo2000转染siRNA或阴性对照序列，孵育48h后收集细胞，采用RT-PCR法检测RNA敲减效率。siRNA寡核苷酸序列：si_circ_0016788-1#5′-CTTCAGGCACAGGTAGGTCT-3′，si_circ_0016788-2#5′-CTACTTCAGGCAGTCTTCC-3′，si_circ_0016788-3#5′-AGGCACAGGTCTTCCCAAGGG-3′。

1.4 细胞迁移及侵袭实验 取转染后状态良好的实验组和对照组细胞，胰酶消化收集细胞，使用无血清培养基调整细胞密度为5×105/ml，将细胞悬液以200μl/孔加入Transwell上室（侵袭实验需要事前铺一层胶在小室中），加入600μl培养液在下层小室；孵育24h，使用棉花球将上层未通过小孔的细胞擦去，而通过小孔的细胞作甲醛固定、结晶紫染色，并在显微镜下计数。

1.5 统计学处理 应用SPSS 20.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用两独立样本t检验。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。绘制Kaplan-Meier曲线，hsa_circ_0016788高、低表达者生存率比较采用log-rank法。采用Cox比例风险模型分析影响结直肠癌患者预后的因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织与癌旁正常组织中hsa_circ_0016788表达的比较 结直肠癌组织中hsa_circ_0016788相对表达量为4.26±0.15，明显高于癌旁正常组织的1.59±0.16（P＜0.05）。

2.2 结直肠癌组织中hsa_circ_0016788表达与患者临床特征的关系 结直肠癌组织中hsa_circ_0016788表达与患者N分期、TNM分期有关（均P＜0.05），与患者年龄、性别、T分期等均无关（均P＞0.05），见表1。

表1 结直肠癌组织中hsa_circ_0016788表达与患者临床特征的关系[例（%）]

2.3 hsa_circ_0016788对结直肠癌细胞迁移及侵袭能力的影响 对4株结直肠癌细胞（HT-29、HCT116、SW480、LOVO）和1株正常肠上皮细胞（HCO）中hsa_circ_0016788表达进行检测，结果发现4株结直肠癌细胞中hsa_circ_0016788 相对表达量（4.17±0.20、3.47±0.25、3.20±0.20、1.83±0.25）均明显高于正常肠上皮细胞（1.00±0.23），差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1a。选取HCT116转染3个siRNA敲减circ_0016788，siRNA 1#效果明显，hsa_circ_0016788表达明显下调（P＜0.05），见图 1b。选择siRNA 1#进行功能实验，敲减hsa_circ_0016788后，HCT116细胞的迁移、侵袭能力均明显下降（均P＜0.05），见图 2（插页）。

图1 结直肠癌细胞中hsa_circ_0016788相对表达量比较（a：4株结直肠癌细胞及1株正常肠上皮细胞中hsa_circ_0016788相对表达量比较；b：HCT116细胞转染si-circ_0016788后hsa_circ_0016788相对表达量比较）

图2 体外细胞实验敲减hsa_circ_0016788后对HCT116细胞迁移及侵袭能力的影响（a、c：HCT116细胞转染si-circ_0016788后迁移能力明显下降；b、d：HCT116细胞转染si-circ_0016788后侵袭能力明显下降；结晶紫染色，×100）

2.4 结直肠癌组织中hsa_circ_0016788表达与患者预后的关系 经生存分析，发现结直肠癌组织中hsa_circ_0016788高表达的患者总体生存率低于低表达者（P＜0.05），见图3a。对Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者分别进行生存分析，均为hsa_circ_0016788高表达患者生存率低于低表达者（均P＜0.05），见图3b-c。经Cox比例风险模型分析，结直肠癌组织中hsa_circ_0016788高表达是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素（RR=22.712，P＜0.05），见表 2。

图3 结直肠癌患者hsa_circ_0016788高、低表达者的Kaplan-Meier生存曲线（a：80例结直肠癌患者；b：39例Ⅱ期结直肠癌患者；c：36例Ⅲ期结直肠癌患者）

表2 影响结直肠癌患者预后因素的Cox比例风险模型分析

3 讨论

本研究结果发现，结直肠癌组织中hsa_circ_0016788相对表达量明显高于癌旁正常组织，这表明hsa_circ_0016788可能参与了结直肠癌的发生，其高表达可能促使结直肠癌细胞增殖或突变，从而形成肿瘤。肿瘤细胞一般先侵袭局部基底膜或微血管转移至局部淋巴结，再通过淋巴循环或血循环形成远处转移，因此肿瘤是否具有侵袭性、有无局部淋巴结转移对判断预后十分重要[12-15]。本研究进一步分析发现，hsa_circ_0016788表达与N分期（淋巴结转移）有关；体外迁移实验和侵袭实验验证hsa_circ_0016788能促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭，提示hsa_circ_0016788可能具有促使结直肠癌患者发生肿瘤局部侵袭及远处转移的作用。Zhang等[16]报道了由hsa_circ_0016788翻译而来的三维序列包含蛋白11，通过上皮间质转化（EMT）过程来促进肝癌细胞的侵袭和转移。然而，EMT过程在肿瘤侵袭、转移过程中广泛存在，该过程将上皮细胞重新编程，使其具有间充质表型，更易发生远处转移[17]。因此，笔者推测hsa_circ_0016788也可能通过EMT过程来促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移，但是需要后期实验进一步验证。既往研究表明，hsa_circ_0016788具有促进肝癌细胞增殖的功能[11]；但本研究未发现hsa_circ_0016788与结直肠癌细胞增殖有关。本研究发现，hsa_circ_0016788高表达的结直肠癌患者总体生存率明显低于低表达者，结直肠癌组织中hsa_circ_0016788高表达是影响患者预后的独立危险因素。

综上所述，hsa_circ_0016788可能促进了结直肠癌的迁移和侵袭，后期仍需动物实验和体内实验进一步验证；同时其高表达提示结直肠癌患者预后不良。