徐娇 朱楚然 都明理 王丽红 隋春 魏建和

摘要：利用带有促溶标签SUMO和纯化标签6×His的原核表达载体，构建了调控北柴胡皂苷生物合成的转录因子基因BcAP2-13的原核表达载体p13-SUMO-His6。载体热激转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）后，用异丙 基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导培养，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明，28 ℃和37 ℃不同温度诱导条件下均得到了融合蛋白13-SUMO-His 6。以Ni-NTA柱纯化的融合蛋白为抗原，免疫成年兔4次以制备多克隆抗体。间接酶联免疫法检测结果表明，所得抗体效价较高。提取北柴胡毛状根及BcAP2-13超表达毛状根的总蛋白，免疫印迹检测结果表明，在2种毛状根蛋白样品中均能检测到与预计13-SUMO-His6蛋白分子量大小一致的条带，BcAP2-13过表达毛状根总蛋白样品的条带强于普通毛状根总蛋白样品的条带，与预期一致。成功制备了北柴胡BcAP2-13的多克隆抗体，为进一步研究北柴胡转录因子BcAP2-13的确切作用位点和调控机制奠定了基础。

关键词：北柴胡;转录因子;原核表达;多克隆抗体制备;免疫印迹

中图分类号： S188;S567.7+90.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0066-03

1994年Jofuku等首次發现了AP2/ERF转录因子在模式植物拟南芥[Arabidopsis thaliana （L.）Heynh]中调控花发育[1]。AP2/ERF是植物特有的一类转录因子，含有由60～70个氨基酸组成的AP2/ERF结构域[2]。AP2/ERF类转录因子参与水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯、脱落酸（ABA）等多种信号转导途径[3-5]，已证实其中多个转录因子调控重要药用植物的药效成分合成。如在转基因长春花中过表达 ORCA3-G10H提高了长春质碱、阿玛碱的含量，降低了脱水长春碱和长春碱含量[6]。黄花蒿中的一个AP2转录因子TAR1在调控腺毛形态、表皮蜡质组成和青蒿素含量中起至关重要的作用。抑制TAR1基因表达降低青蒿素含量，基因过表达则增加青蒿素含量[7]。笔者所在课题组前期克隆到了1个AP2/ERF类转录因子基因BcAP2-13，间接试验证实了这个转录因子调控柴胡皂苷生物合成，为直接证实其调控作用，找到其直接作用的基因靶点，Chip免疫共沉淀是重要方法之一，利用这一方法有必要先获得BcAP2-13的特异抗体。蛋白特异抗体在蛋白功能的研究中发挥着重要的作用，为基因编码蛋白功能的研究提供必要条件[8-9]。本研究利用大肠杆菌原核表达获得了BcAP2-13的融合蛋白，Ni-NTA亲和柱纯化后作为免疫原，制备了BcAP2-13的多克隆抗体。间接酶联免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定了抗体的效价，Western-blot印迹检测了抗体的特异性，为进一步深入开展BcAP2-13基因功能的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物、细菌和载体 北柴胡毛状根为笔者所在课题组前期由发根农杆菌诱导北柴胡无菌苗获得，北柴胡BcAP2-13超表达毛状根是由含有BcAP2-13基因的发根农杆菌诱导获得。大肠杆菌TOP10菌株、大肠杆菌BL21（DE3）菌株和原核表达载体pET-28a-sumo购自武汉戴安生物科技有限公司。

1.1.2 试剂 高保真DNA聚合酶（PrimeSTARHS DNAPolymerase）购于宝日医生物技术（北京）有限公司;BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ内切酶、T4 DNA连接酶购于NEB公司;DNA纯化回收试剂盒（Universal DNAPurification Kit）、质粒小提试剂盒（TIANprep Mini PlasmidKit）购于天根生化科技（北京）有限公司;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、弗氏完全佐剂（Freunds adjuvantcomplete）和弗氏不完全佐剂（Freunds adjuvant incomplete）购于Sigma公司;0.45 μm硝酸纤维素膜（Nitro Cellulose）购于GE Healthcare Life Science;辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，简称IgG）购于北京康为世纪生物科技有限公司;尿素购于Amresco公司;ECL工作液（Detection reagent 1，Detection reagent 2）购于BioRad公司。SDS-PAGE预制胶购于武汉金斯瑞公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原核表达载体构建 根据BcAP2-13基因序列，设计基因扩增正向序列PL040F：5′-CGCGGATCCATGATGCAATCAAATTTTG-3′和反向序列L040R：5′-GACGTCGACTCAAACAATTAAAAAAG-3′（划线部分为酶切位点）。以BcAP2-13-PDOR221重组载体质粒为模板进行PCR扩增，PCR条件为94 ℃ 5 min;98 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃ 10 min。回收PCR产物，BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后与同样双酶切后的pET-28a-sumo载体相连，得到重组质粒 p13-SUMO-His6，而后转入大肠杆菌感受态DH5α，通过测序验证重组载体中基因序列的正确性。

1.2.2 重组表达载体p13-SUMO-His6在大肠杆菌中的表达 （1）小样表达：提取质粒p13-SUMO-His6，转入大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3），挑选转化平板的6个单克隆，分别接种3 mL卡那抗性液体培养基，37 ℃，220 r/min摇培至D600 nm值为0.5～0.6，加入IPTG终浓度为0.5 mmol/L，20 ℃诱导表达3.5 h。离心收集菌体，移除上清液，按10 mL PBS/g 菌体的量重悬菌体;利用超声破碎仪进行菌体细胞破碎，SDS-PAGE检测表达情况。结果显示蛋白质在上清和包涵体中均有表达，且上清中的量满足继续进行大量表达纯化。