鲍宇宏

【摘 要】以山杏内种皮为原料，高效液相色谱-紫外检测器法测定磷脂含量，采用ZORBAX Rx-SIL型硅胶柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流动相为乙腈-甲醇（15：85，体积比），流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量20 μL，测得山杏内种皮中磷脂酰乙醇胺（PE）含量为0.393 4 mg/g。

【关键词】磷脂；高效液相色谱分析；山杏内种皮

山杏是我国北方干旱山地丘陵区特有的经济林树种，目前对山杏的研究主要集中在对山杏仁的研究，山杏内种皮通常作为杏仁加工废料被丢弃，未见有对磷脂类物质提取及分析的报道。本文以山杏内种皮为原料，研究山杏内种皮磷脂类化合物，利用高效液相色谱法测定含量，以便为生产中提取、测定山杏内种皮磷脂类化合物提供技术依据，为山杏资源的充分开发利用提供参考。

一、材料与方法

1.1仪器

AR1140型电子天平：梅特勒-托利多公司；KQ-500DE型超声波清洗器：昆山舒美超声仪器有限公司； TGL16M型高速冷冻离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；DGG-9023A电热恒温真空干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；JP-500C粉碎机：永康市久品工贸有限公司； Milli-Q Academic超纯水仪：美国密理博公司；ZORBAX Rx-SIL：美国安捷伦公司；LC-16高效液相色谱仪：日本岛津公司；SPD-16检测器：日本岛津公司。

1.2 材料与试剂

山杏仁，浸泡去皮，种皮洗净，风干，粉碎，过筛（80目），干燥器中保存。

磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）标准品：Sigma公司；甲醇、乙腈、正己烷、无水乙醇：天津市大茂化学试剂厂；氯仿、氯化钠：天津市津科精细化工研究所。液相色谱所用试剂均为色谱纯，且经过0.45 μm滤膜过滤并超声脱气。其他试剂均为分析纯。

1.3方法

1.3.1 制备磷脂类化合物标准溶液

精密称取一定量的磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）标准品分别置于2 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得标准品储备液，各标准品质量浓度分别为PG：1.60 mg/mL，PC：1.60 mg/mL，PE：1.40 mg/mL。分别移取一定量的各标准品储备液于2 mL容量瓶中，用甲醇定容得混合标准溶液。

1.3.2 制备样品

称取样品1.000 0 g，加入正己烷-甲醇（1：1，体积比）试剂15 mL，超声功率450 W，超声提取50 min，放置至室温，加正己烷-乙醇提取试剂补至原重，6 000 r/min离心10 min，取上清液用适量的0.75 %氯化钠溶液萃取2次，收集有机相。将有机相旋转浓缩至近干，用甲醇定容至10 mL。取样品溶液1 mL，甲醇稀释至10 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤，待测。

1.3.3 色谱条件

色谱柱为ZORBAX Rx-SIL柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈：甲醇=15：85（体积比）；等度洗脱；流速为1.0 mL/min；柱温为35 ℃；检测波长为206 nm；进样量为20 μL。

二、结果与分析

2.1 流动相的选择

试验考察了流动相为乙腈、甲醇、乙腈-甲醇等不同组成及比例时3种磷脂类化合物的分离情况。试验结果可知，由流动相为100 %甲醇或100 %乙腈时，PG和PE出峰时间相近，分离度差，最终确定乙腈-甲醇（15：85，体积比）为流动相。

2.2 流速的选择

试验中选取流速分别为0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min，考察流速的不同对磷脂各组分的分离度、出峰时间及信号强度的影响。流速越小，出峰越慢，且峰形不好，分叉或跟有若干小峰，流速越大，出峰时间越快，峰形越好，但PE与PG出峰时间越接近。综合考虑，确定流速为1.0 mL/min。

2.3 柱温的选择

试验考察了不同柱温对分离效果的影响。色谱柱温度升高，柱压下降，色谱峰与杂质分离充分，峰形良好，利于检测结果的分析，但长时间保持较高温度，磷脂易发生氧化或分解反应，导致检测结果不准确。试验结果表明，在 35 ℃的条件下检测效果最好。

2.4 色谱条件的优化

根据试验结果，高效液相色谱法分析磷脂类化合物的条件：流动相为乙腈-甲醇（15：85，体积比），流速為1.0 mL/min，柱温为35 ℃。在此条件下，3种磷脂类化合物标准品色谱分离情况最佳。

2.5 标准曲线的绘制

分别取1.3.1制备的磷脂标准品储备液，用甲醇稀释成一系列标准工作液，按1.3.3色谱条件进行测定。以标准品浓度为横坐标，以峰面积×10-6值为纵坐标进行线性回归。以信噪比S/N=3测定的结果计算检出限。

2.6 精密度试验

将混合标准品溶液按1.3.3色谱条件进行测定，重复测定6次，3种磷脂化合物峰面积的RSD值分别为：PG1.53 %， PC1.01 %， PE1.17 %，仪器精密度良好。

2.7 样品测定

精密称取山杏内种皮样品，按1.3.2试验方法处理，在1.3.3色谱条件下测定，平行测定6次。根据回归方程计算山杏内种皮PE含量为0.3934mg/g。

2.8 稳定性试验

将样品溶液按1.3.3色谱条件每隔2小时测定一次，重复6次，PE峰面积的RSD值为1.23 %，样品溶液在10 h内稳定。

2.9 回收率试验

称取山杏内种皮样品1.0000g置于具塞锥形瓶中，分别加入一定体积的磷脂标准品储备液，按1.3.2试验方法处理样品，按1.3.3色谱条件测定。

三、结论

本文探讨了高效液相色谱检测山杏内种皮中磷脂类化合物的方法。采用ZORBAX Rx-SIL型硅胶柱（4.6 mm×250 mm， 5μ m），检测磷脂类化合物条件为：流动相为乙腈-甲醇（15：85，体积比），等度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为20 μL，山杏内种皮磷脂酰乙醇胺（PE）含量为0.393 4 mg/g。本研究为山杏资源的进一步开发利用提供一定的参考。

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