方强强 王燕

摘要：以岩陀植物叶片为材料，利用试剂盒提取方法提取植物叶片中的DNA，对ITS2序列进行PCR扩增条件优化并对ITS2序列鉴别物种能力进行考察;通过单因素实验分别研究退火温度、DNA模板量、循环次数等因素对岩陀DNA条形码鉴别中所选的ITS2序列扩增反应的影响，并对扩增体系进行优化，采用Seqman7.1软件对测序峰图进行校对拼接，应用MEGA计算种内种间遗传距离，采用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树;结果表明：优化后的PC R扩增反应体系总体积为25μL， 含TaqPCR Master Mix 12.5μL、DNA模板量5ng、上下游引物（10mol/L）各1μL、ddH2O9.5μL，ITS2序列在退火温度设置为60℃，循环次数为30次的条件下进行PCR扩增，获得清晰单一的电泳条带，ITS2测序成功率100%，比对后的序列长度475bp，GC含量约50%、种内种间变异存在重叠，没有明显的Barcoding gap;结论：通过试剂盒提取岩陀植物叶片DNA，在优化后的PCR扩增反应体系对ITS2序列进行扩增，可以满足后续对鬼灯檠属多基原植物岩陀的亲缘关系、物种鉴别和遗传多样性等领域的研究，但ITS2序列不适合岩陀种DNA条形码鉴别。

关键词：岩陀;DNA提取;核糖体ITS2;PCR扩增条件;侧序;分子鉴别

岩陀来源于虎耳科鬼灯擎属植物西南鬼灯檠（Rodegersia sambucifolia Hems1）或羽叶鬼灯檠（Rodegersia pinnata Franch）干燥根茎Ill，为苗族、白族、傈僳族等民族常用药材，分布于我国云南、贵州、四川、陕西、甘肃、宁夏、河南、湖北、西藏等省区，而云南省资源最为丰富，3种鬼灯檠：西南鬼灯檠（Rodegersiasambucifolia Hemsl.）、七叶鬼灯檠（Rodegersia aes-culigolia Batalin）、羽叶鬼灯檠（Rodegersia pinnataFranch）均有分布。因其具有清热解毒、收敛、消炎、祛风除湿等功效[2]，对肠炎、菌痢、风湿骨痛、外伤出血、老年性支气管炎等常见疾病有较好疗效而得以广泛使用[3]。但由于多基原民族药岩陀利用传统方法很难鉴别，3种鬼灯檠来源的岩陀药材混淆使用，用药安全难以保证。因此，为了保证中药临床用药的安全有效可控，利用生物学方法（DNA条形码技术）构建岩陀DNA条形码识别系统很有必要，而建立DNA条形码系统的前提条件为DNA提取及PCR擴增条件的选择与优化。DNA条形码技术是一项新的分子鉴别技术，摆脱传统鉴别方法中需要丰富的物种鉴别知识的束缚，而且还可以构建相应数据库，实现物种快速准确鉴别[4]。因此，本研究中选用植物DNA条形码鉴别中常用序列ITS2，进行物种鉴别能力考查，以期为其它药用植物在种属鉴别方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：植物组织研磨仪、Ohaus corporation CP114型电子天平、SIGMA1-14ED台式离心机、VOR-TEX-kylin-Bell型旋涡震荡仪，DYCP-31DN型电泳仪、Bio-Rad SmartSpec Plus蛋白质核酸定量检测仪、Bio-Rad My Cycler型PCR扩增仪。

试剂：乙二胺四乙酸二钠（Ethylene diamine te-traacetic acid，EDTA）、Tris（北京索莱宝）、溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）、6×DNA Loading buffer（北京索莱宝）;琼脂糖（Agarose LE）、DNA quick Plant System（非离心柱型）、Taq PCR Master Mix（2x，red dye）、DNAMarker[均购自北京天根生化科技有限公司;硼酸、异丙醇、氯仿、氢氧化钠、无水乙醇、氯化钠等为国产分析纯。

1.2 材料采集与处理

实验研究所用鬼灯檠属的3个品种的岩陀植物由课题组成员2018年7月采自云南省大理苍山。样品由大理大学药学与化学学院生药教研室张德全博士鉴定完成，凭证植物标本存放于大理大学药学与化学学院王燕课题组，样品采集信息表见表1。

1.3 DNA的提取

采用试剂盒法，取经硅胶干燥处理后的岩陀植物叶片约20mg于离心管，加入400μLFP1和6KLRNase，旋涡振荡1min，室温放置10min：后加入130μL缓冲液FP2，混匀旋涡振荡1min，12000rpm离心5min，取上清液于新的离心管中，重复操作1次;向上清液加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀12000rpm离心2min，弃上清液;加入600μL70%乙醇，旋涡振荡5s，12000rpm离心2min，弃上清液，重复操作1次;开盖倒置5～10min，加入50μL缓冲液TE，充分混匀使其溶解，-20℃贮存备用。

1.4 DNA纯度的检测

将提取的DNA溶液适当稀释后，采用核酸蛋白成像仪进行纯度检测，记录A₂₆₀和A₂₈₀吸光光度值，以A₂₆₀/A₂₈₀的比值鉴定纯度。采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳，0.5*TBE buffer（54g Tris，27.58硼酸，20mL 0.5mol/LEDTA（pH值8.0》，琼脂糖凝胶成像仪观察并拍照。

1.5 ITS2序列扩增反应和程序

PCR扩增在Bio-Rad MyCler型PC R扩增仪进行扩增，引物参考陈士林[4]课题组设计的序列，由生工生物工程（上海）公司合成。引物序列为：ITS2F ATGC-GATACTTGGTGTGAAT;ITS3R GACGCTTCTCCA-GACTACAAT。

PCR扩增反应体系中的Taq PCR Master Mix采购自北京天根，加入量按产品说明为准;引物浓度10μM;样品DNA模板加入量1 μL（1-10[，g/mL）。初始反应程序为：第1阶段：预变性，94℃，4min;1个循环;第2阶段：变性，94℃，30s;退火，45～68℃，30s;延伸，72℃，45s：30～35个循环;第3阶段：72℃10min，1個循环，终止反应，4℃保存。

1.6 ITS2测序及物种鉴别

PCR扩增的序列送至华大基因科技（武汉）有限公司进行双向测序。利用seqman7.1去除序列低质量区和引物区并对测序峰图进行校正拼接，利用软件MEGA7.0计算种内种间遗传距离值并构建系统发育树，利用Taxon DNA软件对种内种间遗传距离分布进行概率统计，并绘制Barcoding gap图，比较种内种间遗传差异，对ITS2序列鉴别能力进行评估。

2 结果与分析

2.1 DNA提取

试剂盒提取结果如图1，试剂盒提取的总DNA条带明亮，但由于试剂盒本身的原因，总DNA条带中部分条带存在弥散和点样孔有亮斑的现象，可能存在少量蛋白质、糖类、酚及RNA等杂质没有去除干净，植物总DNA提取过程中总DNA中存在少量杂质的污染，不会对后续PCR扩增产生影响。条带存在但采用试剂盒提取方法提取DNA方便快捷，课题组在利用不同方法提取DNA的过程中发现，利用试剂盒提取方法对经硅胶干燥叶片的提取DNA效果较佳。故本试验采用试剂盒提取样品DNA。

2.2 ITS2序列PCR扩增条件优化

2.2.1 退火温度的优化。退火温度是影响PCR特异性的重要因素，变性后温度快速冷却至40～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机率会远高于模板互补链之间的碰撞[5]。不同的引物有着不同的退火温度，而退火温度的选择取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度（对于序列数在20bp，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度最为理想。引物理论退火温度Tm=4（G+C）+2（A+T）[6]。实际退火温度要根据具体样品的不同择优选择，实验设定44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃等10个梯度的退火温度，10种退火温度以筛选最合适的退火温度结果见图2。当退火温度在44～62℃之间均能有效扩增且条带明亮，3～10号条带非特异性扩增较明显。随着退火温度升高至60℃，PCR反应特异性略有提高。退火温度高于60℃时，扩增效率无明显改变，但扩增特异性有所下降，ITS2序列扩增退火温度选择60℃比较合适。在Tm值允许范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。退火时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合[6]。后续条件优化均在该优化退火温度基础上完成。

2.2.2 DNA扩增模板量的选择。DNA扩增所加入的模板量也是影响PCR扩增的重要因素，模板量少影响PCR扩增产物的浓度，模板量多又会出现非特异性扩增。因此，为了获得最佳扩增条带，考察模板加入量很有必要。实验样品选择101号样品，核酸浓度检测该样品A₂₆₀=0.164，A₂₆₀/₂₈₀=1.85，样品提取浓度为45.8592μg/mL，在25μL的反应体系中设定8个DNA模板用量梯度，加入模板DNA量分别为0.05ng/25μL、0.2ng/25μL、0.4ng/25μL、2ng/25 μL、5ng/25μL、20ng/25μL、40ng/25μL、70ng/25μL。不同模板加入量得到的扩增结果如图3，模板原液加入量在5～40ng的范围内DNA条带明亮，考虑节约模板量与实验的操作的准确性，选择每25μL反应体系加入模板量为5ng较为合适。

2.2.3 扩增循环次数。确定合适的退火温度和DNA模板加入量后，选择合适的循环次数可以降低非特异扩增量。实验设定6个循环次数进行扩增DNA扩增结果如图4，表明PCR扩增反应第2阶段30个循环较为合适，该条件同时满足目标产物的扩增量和低非特异扩增量。

2.2.4 优化条件组合的PCR扩增结果。以优化条件组合对岩陀10个品种提取的DNA模板进行PCR扩增，扩增后的结果在1.5%的琼脂糖凝胶电泳，0.5*TBE buffer，溴化乙锭染色，琼脂糖凝胶成像仪拍照观察如图5，在500bp处有一条明亮的条带，表明优化条件适合ITS2反应要求。

2.2.5 ITS2片段的PCR产物则序及序列数据处理。10条ITS2序列，由华大基因科技（武汉）有限公司进行双向测序，测序成功率100%。测序所得峰图采用Seq-man7.1.0进行校对拼接，去除引物区和低质量区，运用MEGA7.0软件对拼接后的序列进行比对，基于Kimu-rat-Parameter双参数模型和距离法中的（neigh-bor-joining，NJ）计算遗传距离，构建Barcoding gap图和系统发育树，系统发育树中各分支相对支持率采用Bootstrap模式检测，自展次数设置为1000，Gap/missingDate Treatment模式选择complete deletion计算。

3 ITS2序列鉴别分析

3.1 ITS2序列特征

各样本所得的ITS2序列经MEGA比对后所得序列长度为475bp，GC含量50.84%，保守位点99.6%，变异位点0.2%，简约信息位点0.2%，变异位点较低，利用ITS2序列作为种下鉴别较为困难。

3.2 ITS2序列种内种间差异性分析

利用MEGA7.0软件计算鬼灯檠属岩陀种不同样品之间的遗传距离，K2P计算结果表明，种内种间平均遗传距离分别是0.00079和0.00099，种间遗传距离分布于0～0.00213。种内种间差异性分析见表2，理想的DNA条形码应该满足：种间最小遗传距离大于种内最大遗传距离，但表2数据结果表明最小种间遗传距离的平均值为零。因此，ITS2种内种间差异性分析并不能很好的表明ITS2对岩陀种间的鉴别能力。

3.3 ITS2序列Barcoding gap检验

MEGA7.0软件计算样品种内种间遗传距离值，采用Taxon DNA软件对种内种间遗传距离概率分布进行统计，并制作出ITS2序列的Barcoding gap图，见图6。如图所示，ITS2序列的种内种间变异重叠很大，没有明显的Barcodinggap。

3.4 ITS2序列構建系统发育分析

3.4.1 ITS2碱基替换饱和性检验。系统发育树的构建基于建树序列是否达到饱和，针对已经达到饱和的序列不太适合建树，因此对ITS2序列建树之前进行碱基替换饱和性检验很有必要。ITS2序列序列饱和性检验值如表3所示，Iss.c（转换值）远远大于Iss（替换值）且P值为0，说明ITS2碱基替换没有达到饱和，适合遗传发育树的构建。

3.4.2 NJ法构建系统发育树。为了增大样本量，构建系统发育树的序列除了课题组采集的10个样品外，还从GeneBank下载了七叶鬼灯檠序列4个，西南鬼灯檠3个、羽叶鬼灯檠2个及1个梅花草属梅花草基因作为外类群，GeneBank ID：MH045282.1、MH045359.1、MH045360.1、MH045366.1、MH045376.1、MH045377.1、MH045375.1、MH045341.1、MH045343.1、JF811095.1。采用NJ法对序列构建系统发育树，判断各样品分支情况，结果见图7，从基因库下载的序列的9个序列及课题组代表性样品序列均不能很好聚为一支，说明ITS2序列在岩陀种之间的鉴别并不理想，不适合作为岩陀种间的鉴别序列。

4 讨论与小结

从核酸体外扩增的设想到聚合酶链式反应的发明，历经10年之久，为分子生物学及其相关领域的研究提供了经典的实验方法。PCR扩增反应是特异的、高效的，任何一种因素控制不当都会影响目标产物的扩增。针对不同的研究对象和仪器，均需要摸索其最佳反应条件，这是利用分子生物学鉴别物种和遗传多样性研究的基础。影响PCR扩增反应的因素有很多。首先，引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。在引物的设计过程中应该注意到：①引物的长度不能过长，一般为20bp左右;②引物碱基中G+C含量以45%～55%[7]为宜，G+C含量太少扩增效果不佳，G+C含量过多易出现非特异条带。碱基A、T、G、C最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶脱氧核苷酸的成串排列。其次，Taq DNA聚合酶的浓度，PCR扩增反应是DNA的体外扩增，选择合适的酶量对扩增反应能否顺利进行至关重要;再者，缓冲系统、dNTP的浓度、Mg²⁺的量的影响，选择合适的浓度配比即是对Taq DNA聚合酶提供合适的反应环境，也是对扩增率的保障。最后，就是对模板浓度、温度、循环周期的筛选。总之，在PCR特异性扩增反应中应该保证目标产物量的最大化。严格控制退火温度，适当提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性;减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸;适当降低引物及酶的浓度可以减少非特异性扩增的发生;有效调整Mg²⁺浓度，降低Mg²⁺的浓度对Tap DNA聚合酶的活性有直接的影响;PCR扩增产物要尽快完成电泳检测，延时电泳检测会出现电泳条带不规则或消失的现象。

针对ITS2序列对岩陀种间鉴别能力研究，本研究采用种内种间遗传差异分析，Barcoding gap及系统发育3个方面的分析，均不能很好对岩陀3个种进行鉴别。笔者通过阅读大量文献得出，ITS2在种水平鉴别率达到97.2%[8]，但作为岩陀种DNA条形码鉴别不太适合。因此，课题组在今后岩陀种DNA条形码鉴别研究中准备采用叶绿体基因psbA-trnH、matK、rbcL序列及多片段组合的方法对岩陀种（西南鬼灯檠、七叶鬼灯擎、羽叶鬼灯檠）的3个物种进行鉴别研究。另外，本研究中虽然未能利用ITS2序列对岩陀种进行区分鉴别，但实验中建立的PCR扩增反应体系希望能为其它DNA条形码鉴别研究中PC R扩增条件的探索提供借鉴和帮助。（收稿：2018-12-20）

参考文献：

[1]湖南省卫生厅.湖南省中药材标准[M].2010.

[2]王燕，鲍家科，金杨，等.岩陀药材质量标准研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：85-88.

[3]李萍萍，孟衡玲，陈军文，等.云南岩陀及其近缘种质资源群体表型多样性[J].生态学报，2012，32（24）：7747-7756.

[4]陈士林.中药DNA条形码分子鉴定[M].人民卫生出版社，2012.

[5]卢圣栋.现代分子生物学实验技术.第2版[M].北京：中国协和医科大学出版社，1999.

[6]顾红雅.植物基因与分子操作[M].北京：北京大学出版社，1995.

[7]王艳秋，张培军.PCR引物设计[J].海洋科学，1995，19（5）：9-10.

[8]Chen S，Yao H，Han J，et al.Validation of the ITS2 region as a novelDNA barcode for identifying medicinal plant species[J].Plos One，2010，5（1）：e8613.