张慧， 生秀梅， 舒扬， 向敏， 阴晴△

1江苏大学附属医院检验科(江苏镇江 212001)； 2江苏大学医学院检验医学系(江苏镇江 212013)

近20年来，随着临床大量使用头孢菌素类抗生素治疗肠杆菌科细菌引起的感染性疾病，导致超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)在肠杆菌科细菌中的流行[1-4]。由于碳青霉烯类抗菌药物抗菌谱广、活性强、不良反应少，且对AmpC 酶和超广谱β-内酰胺酶稳定，临床常用其治疗对头孢类抗生素耐药肠杆菌科细菌引起严重感染。随着用量的增加，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)也在逐年递增，耐药机制主要是产生了碳青霉烯酶[5-8]。本文研究的 NDM-1碳青霉烯酶属于B类金属酶，2009年印度新德里首次报道，又称新德里金属β-内酰胺酶，几乎能水解所有β-内酰胺类抗生素[9-11]。2010中国首次报道，之后各地对NDM-1基因分布情况也均有报道[12-13]，携带NDM-1碳青霉烯酶的细菌会对临床常用多种抗生素呈高度耐药，临床治疗此类感染十分棘手。本文收集江苏大学附属医院45株CRE，分析NDM-1型碳青霉烯酶基因携带率及常用抗生素耐药情况,为我院临床治疗和防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集江苏大学附属医院2017 年1月至2018 年6月各类送检标本中分离出的CRE共45 株，标本来源包括痰标本30株，分泌物标本5株，胆汁标本1株，全血标本2 株，脓液标本2，中段尿标本4株，咽试子标本1株。剔除同一患者、同一标本类型重复菌株。

1.2 主要试剂 革兰阴性杆菌鉴定卡GN卡及革兰阴性杆菌药敏卡AST-GN13(上海梅里埃诊断产品有限公司)；血平板培养基及M-H培养基购置于(上海科玛嘉微生物技术有限公司)；亚胺培南E-test试纸条及美罗培南药敏纸片(温州市康泰生物科技有限公司)；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA) 为江苏大学医学院惠赠；Agarose琼脂粉(BIO-FRoxx公司)；核酸染料(上海翌圣生物科技有限公司)；PCR反应试剂及 Marker DL2000(上海皓嘉科技发展有限公司)；凝胶电泳 Marker DL2000；引物合成(上海生工生物工程股份有限公司)

1.3 主要仪器 VITEK-2 COMPACT鉴定仪；S1000TMThermal Cycler PCR仪(BIO-RAD公司)；DYY-68稳流稳压电泳仪(南京新校园生物技术研究所)；凝胶成像分析系统JS-680D(上海培清科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株鉴定及药敏试验 取过夜培养的纯菌落于3 mL 0.45%生理盐水中,调节菌液浓度0.51～0.62麦氏单位，放置GN卡，由VITEK-2 COMPACT细菌鉴定仪鉴定，无菌枪头吸取0.51～0.62麦氏单位的菌液145 μL于另一支3 mL 0.45%生理盐水中，上AST-GN13药敏卡，VITEK-2 COMPACT细菌鉴定仪药敏试验。筛出CRE,再重新挑取纯培养的CRE的单个菌落放于1.5 mL 0.9%生理盐水中，调节菌液浓度0.50麦氏单位，无菌棉拭子浸入菌液中，将多余菌悬液挤出， 均匀涂布整个M-H琼脂板，旋转M-H琼脂板60℃，重复涂布3次，最后用棉拭子涂抹琼脂边缘，无菌镊子夹取亚胺培南E-test试纸条贴于M-H琼脂板中央，置于35℃培养箱中孵育16～18 h，复查药敏试验结果。依据2018版CLSI药敏解释判断标准进行判断：厄他培南MIC≤0.5 μg/mL敏感(s)，MIC=1中介(I), MIC≥2 μg/mL耐药(R)。亚胺培南MIC≤1 μg/mL敏感(s)，MIC=2中介(I), MIC≥4 μg/mL耐药(R)。

1.4.2 改良的 Hodge 试验 取过夜新鲜培养大肠埃希菌 (ATCC25922) 调制成0.5麦氏单位的菌液，再稀释10倍，无菌棉拭子浸入菌液中，将多余菌悬液挤出，均匀涂布在 M-H 琼脂平板上，中间贴美罗培南(10 μg/片)药敏纸片，用接种环将实验菌株以美罗培南纸片边缘为起点，垂直划线，置于35℃孵育16～18 h，观察结果，抑菌圈内出现矢状生长为阳性，无矢状生长为阴性。

1.4.3 EDPT试验 配制0.5 麦氏单位试验菌株菌悬液，均匀涂布于 M-H 琼脂培养基，贴1张美罗培南(10 μg/片)药敏纸片，然后再贴1张加有10 μL EDTA (0.2 mol/L)干燥美罗培南药敏纸片，2纸片间距≥4 cm，35℃ 过夜培养，若 2 张纸片抑菌圈直径之差≥5 mm 则表示试验菌株EDPT阳性，提示菌株产 B 类碳青霉烯酶。

1.4.4 细菌基因组DNA的制备(煮沸法) 取血琼脂平板上过夜纯培养的实验菌株，无菌挑取2个菌落至装有灭菌双蒸水的1.5 mL EP管中，打匀，100℃煮沸10 min，4℃，9 600×g离心5 min，上清液转入另一灭菌EP管中，-20℃保存备用。

1.4.5 NDM-1酶基因检测 采用PCR技术扩增NDM-1酶基因。引物序列(5′-3′)上游Forward: 5′-CTCGCACCGAATGTCTGGC-3′,下游Reverse: 5′-CATTGGCGGCGAAAGTCA-3′，片段长度374 bp。PCR反应体系：(Ex Taq Version 2.0 plus dye) 25 μL，引物各1 μL,模板1 μL，加灭菌水到50 μL。PCR反应条件：预变性94℃×5 min，98℃变性10 s，59℃ 30 s,72℃ 1 min，共 30 个 循 环,；72℃ 10 min延伸10 min，1.2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪分析并拍照。留取PCR未纯化的目的产物送上海生工生物工程股份有限公司测序部测序，测序结果在 Genebank 中比对分析。

2 结果

2.1 菌株鉴定及药敏试验结果 45株细菌经VITEK-2 COMPACT细菌鉴定仪鉴定26株肺炎克雷伯菌，6株粘质沙雷菌，5株阴沟肠杆菌，5株大肠埃希菌、2株植生拉乌尔菌、1株摩氏摩根菌。其中4株细菌药敏结果显示仅对亚胺培南耐药；4株细菌菌仅对厄他培南耐药,37株细菌对亚胺培南和厄他培南药敏试验结果均显示耐药，E-test试纸条复查亚胺培南药敏结果与VITEK-2 COMPACT细菌鉴定仪药敏结果基本一致，45株细菌符合CRE的判断标准。见表1。表达NDM-1基因菌株对临床常用抗菌药物的耐药情况：碳青霉烯类抗生素厄他培南及亚胺培南的耐药率是100%、88.2%。三代头孢耐药率在94.1%～100%之间。环丙沙星及左氧氟沙星喹诺酮类抗生素的耐药率是94.1%。四代头孢头孢吡肟的耐药率是82.3%；单环β-内酰胺类抗生素的耐药率76.5%；含β-内酰胺酶抑制剂复合制剂的耐药率70.6%。对氨基糖甙类抗生素的耐药率在35.3%～64.7%之间。复方新诺明的耐药率是52.9%。见表2。

表1 45株细菌对碳青酶烯类药物耐药情况分析表棵(%)

表2 17株表达NDM-1基因菌株对临床常用抗菌药物的耐药情况分析表 株(%)

2.2 改良的 Hodge 试验及EDPT结果 45株细菌中共 34 株细菌菌改良Hodge 试验结果呈阳性，阳性率为75.6%。27株EDPT试验结果呈阳性，阳性率为60.0%。17株产NDM-1菌株中，11株改良Hodge 试验阳性结果显示阳性，阳性率为64.7%。阳性菌株包括6株肺炎克雷伯菌35.3%(6/17)、3株大肠埃希菌17.6%(3/17)、1株阴沟肠杆菌5.9%(1/17)、1株植生拉乌尔菌5.9%(1/17)。17株产NDM-1菌株EDPT验结果均呈阳性，阳性率100%，见表3。

表3 17株产NDM-1菌株改良Hodge 试验及EDPT阳性菌株分布 株(%)

2.3 NDM-1基因扩增及测序结果 45株细菌进行PCR扩增有17株细菌在374 bp处扩增出目的条带，留取未纯化的PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司测序,序列经Blast 软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，与已知的NDM-1基因相似性为100%。阳性率为37.8%(图1)。其中肺炎克雷伯菌占64.7%(11/17)，大肠埃希菌占17.6%(3/17)，阴沟肠杆菌占11.8(2/17)，植生拉乌尔菌占5.9%(1/17)。

3 讨论

45株实验菌株改良的Hodge 试验阳性率为75.6%，EDPT试验阳性率为60%。17株产NDM-1菌株改良Hodge 试验阳性率为64.7%，而EDPT验阳性率100%，表明改良的Hodge 试验筛查细菌产碳青霉烯酶的敏感性尚可，而对B类金属酶，敏感性及特异性不高，应联合EDPT共同筛查提高B类金属酶检出率[14-17]。

45株实验细菌，有17株表达NDM-1基因，阳性率是37.8%，涉及多个菌属，以肺炎克雷伯菌为主共11株，其次是3株大肠埃希菌、2株阴沟肠杆菌、1株植生拉乌尔菌。17株阳性标本11株分离自痰标本，4株分离自分泌物，1株分离自中段尿，1株分离于血液。与国内其他医院NDM-1基因分布的菌株类型及标本类型略有差异。并且研究中发现我院一株植生拉乌尔菌表达NDM-1基因。国内外对耐碳青霉烯类药物的植生拉乌尔菌研究较少，仅有少量文献报道植生拉乌尔菌表达KPC，IMP-4及0X-48基因[18-19]。目前国内仅有北京及浙江地区3例植生拉乌尔菌表达NDM-1的报道[20-21]。江苏省地区尚属首例，医院应加以重视。

M:DNA标准条带；1～45:实验菌株；374 bp目的基因的长度

据研究，一般表达NDM-1基因的超级细菌，可能会导致该细菌对多种抗生素耐药，呈泛耐药或多重耐药特性[22-23]。通过我院分离的产NDM-1阳性菌株体外药敏结果也显示对多种抗生素耐药。β-内酰胺类抗菌药物耐药率>70%，其中以三代头孢的耐药率最高达94.1%。原因是由于NDM-1基因编码的产物不仅可以水解碳青霉烯类抗生素，对头孢类的抗生素也有水解作用，并且产NDM-1的细菌同时也会产超广谱β-内酰胺酶，此酶对三代头孢亦有水解作用。喹诺酮类抗菌药耐药率也高达94.1%。氨基糖甙类抗生素中庆大霉素的耐药率达64.7%。有研究表明，携带NDM-1基因的细菌一般也会携带喹诺酮类及氨基糖苷修饰酶耐药基因，导致对两类药物产生耐药。复方新诺明耐药率要低于其他抗生素。由此可见，产NDM-1细菌携带多种耐药基因导致对多种抗生素耐药，并且这些耐药基因可通过质粒、接合子在不同的菌种间传播，存在爆发流行的风险，给临床治疗感染性疾病带来巨大挑战[24-25]。

目前在我院CRE中NDM-1基因的携带率较高，并且该基因的携带者主要分布在ICU重症监护病房、血液科及神经内科，多为高龄抵抗力较差有侵袭性操作的重症感染患者，此类患者往往都有过度使用抗生素的经历，而临床过度使用抗生素多是由于对引起感染的病原体的不明确，凭经验用药。这样的严峻形势下，需要我们临床微生物室不仅要重视分析药敏试验结果，探讨耐药机制掌握细菌的耐药特征，还有加强临床沟通、参与临床查房，指导临床正确收集标本，快速准确鉴定与患者症状相关的病原体并提供相应的药敏实验结果，为临床合理应用抗生素提供依据，在降低多重耐药菌的播散方面发挥更大的作用。同时临床科室在合理应用抗生素的前提下，也要注重重症患者的隔离及环境消毒、诊治护理患者时严格遵守操作规范，避免医源性交叉感染。检验与临床共同携手降低我院NDM-1基因的携带率。