杜睿 张羽玲 曾嘉发 方明亮 Sasho Gligorovski 周振 李雪

摘 要 二次电喷雾电离质谱（Secondary electrospray ionization mass spectrometry， SESI-MS）可实时在线检测人体呼出气中的挥发性有机化合物（Volatile organic compounds， VOCs），但呼出气中VOCs的电离效率会受到源内气体氛围的影响。本研究在自制SESI源的基础上，以超高分辨质谱（Ultra-high resolution mass spectrometer， UHRMS）为分析技术，以人体呼出气中典型内源性化合物丙酮（Acetone）和吲哚（Indole），以及典型基质邻苯二甲酸酐（Phthalic anhydride， PA）和邻苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DP）为目标化合物，初步探究了SESI源内不同气体氛围（氮气（N2）、二氧化碳（CO2）、纯净零气（Zero air））对目标VOCs电离效率的影响。结果表明，在SESI源内通入3种纯净气体，可有效提高呼出气中丙酮和吲哚的信号强度和信噪比;同时，由于降低了源内基质含量，可显著减弱基质干扰。3种纯净气体中，通入N2后的效果最为显著。本研究结果可为SESI源设计及参数设置、呼出气分析方法开发提供重要依据。

关键词 呼气代谢组; 直接质谱分析; 超高分辨质谱; 二次电喷雾电离; 气体氛围

1 引 言

二次电喷雾电离质谱（Secondary electrospray ionization mass spectrometry，SESI-MS）可实时在线检测人体呼出气中挥发性化学成分（Volatile organic compounds，VOCs）[1]，具有无损、实时、无需样品前处理、高通量等优势，已成功用于人体生物钟[2]、诊断肺部疾病[3]、检测人体呼出气中内源性代谢物（如色氨酸）[4]等生物医学研究中。SESI源工作原理为：在常温常压环境中，呼气中的中性分子被电喷雾产生的初级离子电离生成分子离子[2，5～8]（图1）。SESI技术的雏形，即电喷雾形成带电微滴电离气相分子的概念，由Fenn等于1989年首次提出[9]; 2000年，Wu和Hill将这种电离技术命名为SESI[10]。目前，文献中报道的SESI源，都是自制SESI源，直至2018年才有一款商品化SESI源在展会中出现[11]。SESI源易于自组建，且可与多种商业质谱接口耦合[12～14]。从质量分析器的角度，以超高分辨质谱（Ultrahigh resolution mass spectrometer，UHRMS）与SESI源结合，优势最显著。采用UHRMS，根据准确质量数，能提高定性分析的准确性，有效区分同重素[15]。

由于自制SESI源不完全封闭，室内空气会进入源内，与呼出气中待分析的目标化合物（如丙酮、吲哚）竞争初级ESI电喷雾形成的微液滴上的有限電荷，降低目标物的电离效率及检出灵敏度; 而且，对于同时存在于呼出气与室内空气中的VOCs，也会降低目标化合物的信噪比。在SESI源内通入不含VOCs的纯净气体，通过降低源内基质浓度，或可解决上述问题。但目前尚没有SESI源内纯净气体氛围对呼出VOCs以及基质的电离效率的影响研究。

本研究利用自行搭建的SESI源，以呼出气中典型内源性代谢物丙酮（Acetone）[2，13]和吲哚（Indole）[12]，以及室内空气中典型VOCs邻苯二甲酸酐（Phthalic anhydride，PA）[16，17]和邻苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DP）[18]为目标化合物，以UHRMS为检测手段，探究源内不同纯净气体氛围（氮气（N2）、二氧化碳（CO2）、纯净零级空气（Zero air，包含： 79% N2，21% O2，< 1 part per million by volume（ppmv）烷烃类物质））对SESI源电离不同来源VOCs的影响，为优化离子源设计及参数设置、提高呼出气中VOCs检测信噪比提供了依据。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

QExactiveTM四极杆组合静电场轨道阱傅里叶变换超高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）; 自制SESI源是将nanoESI商品源与自制质谱接口组合而成（图2）： nanoESI源（美国Thermo Fisher Scientific公司），自制质谱接口[6]（广州禾信仪器股份有限公司定制），包括一个离子化反应腔和两个进样管（图2A），均为不锈钢材质，目的在于减少呼出VOCs的吸附，同时，进样管与腔体为可拆卸设计，便于定期清理; Milli-Q Integral 5超纯水仪（密理博中国有限公司）; AJH-3080A零气发生器（北京安捷华科技有限公司）。

标准校正液（美国Thermo Fisher Scientific公司）; 甲醇（色谱级，纯度99.9%，美国默克公司）。N2标准气体（纯度 ≥ 99.999%，佛山市佛钢气体有限公司）; CO2标准气体（纯度99.99%，广州市粤佳气体有限公司）。医疗呼吸气体干燥（Nafion）管（内径1.32 mm，长度60 cm，ME 60系列，美国博纯有限责任公司）; 特氟龙（PTFE）管（内径4 mm，上海毕帝塑料公司）; 聚氨酯（Polyurethane，PU）管（内径2 mm， 上海毕帝塑料公司）。1 mL移液枪头（德国Eppendorf公司）。质量流量控制器（量程0～1 L/min，韩国Line Tech公司）; Lzb-3微型玻璃转子流量计（量程0～0.6 L/min，浙江余姚工业自动化仪表厂）。

2.2 样品分析

2.2.1 样品采集 人体呼出气采样流程参见文献[6]，即志愿者（2名，25岁和29岁，女性）通过鼻吸、嘴呼的方式提供呼出气样品。采样前，志愿者用纯水漱口，并在实验室内静坐30 min[2]。采集呼气时，志愿者先深呼吸3次，再采集全呼气[18～20]，一次性呼气吹嘴由1 mL移液枪头改制而成。样品传输管路包括： Nafion管、PTFE管和Lzb-3微型玻璃转子流量计。Nafion管用于去除呼出气中的水汽，避免水汽冷凝在PTFE管内壁、吸附VOCs[6]; PTFE管可减少VOCs吸附损失; Lzb-3微型玻璃转子流量计用于控制呼出气流速。还需说明的是，ID 1.32 mm的Nafion管所允许的最大气体流量为0.4 L/min，所以单次采样时，呼气流速控制为0.4 L/min。每个实验条件下，每位志愿者重复呼气5～6次。

2.2.2 SESI-UHRMS分析 SESI-UHRMS实时在线检测呼出气装置如图2B所示。SESI源有两个进样口： 呼出气样品的进样口和纯净气体的进样口（未通入纯净气体时，源内为室内空气）（图2A）。ESI溶剂为超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm），流速200 nL/min。 ESI电压为+2.5 kV（正离子检测模式）/2.5 kV（负离子检测模式），质谱接口离子传输管温度为150℃。检测模式： 正负离子切换扫描（切换时间0.01 s）; 全扫描，质量数范围m/z 50～300，质谱质量分辨率为140000 FWHM（m/z 200）。

2.3 数据处理

通过软件Xcalibur 3.0确定目标化合物以及质量偏差。通过软件Origin 9.0中“Statistics”功能的“Descriptive Statistics”，“Normality Test”判断原始数据是否服从正态分布; 并通过“Homogeneity of Variance Test”，“Levene's Test”进行方差齐性分析，用One-way ANOVA方法，进行差异性分析，通过均值比较（Means comparision）中的多重比较方法（Tukey's multiple means comparison test）进行组内差异性对比分析。

3 结果与讨论

3.1 定性分析

以N2氛围下SESI-UHRMS实时在线检测人体呼出气的结果为例，志愿者呼出气一级质谱图（背景已扣除）如图3所示。

根据目标化合物的分子结构特征和质子亲和力[22～24]，结合SESI源电离机理[15，25，26]，可知丙酮[2，13]、吲哚[12]、PA[16，17]和DP[18]均会形成质子化分子离子[M + H]+。在志愿者呼气样品实时监测过程中，在m/z 59.0499、118.0651、149.0230和279.1582处分别检测到质谱峰，元素组成鉴别为[C3H7O]+、[C8H8N]+、[C8H5O3]+和[C16H23O4]+，质量偏差（实测值与理论值的差值）为0.8、0.0、0.3和0.9 mDa，可确定上述质谱峰即为呼出气中丙酮、吲哚及室内空气中PA和DP的质子化分子离子（图4）。

3.2 SESI源内气体氛围对呼出VOCs的影响

本研究选择N2、CO2、Zero air作为考察的纯净气体，主要基于如下原因： （1）3种气体理化性质相对稳定，且都是呼出气中的成分（按体积比计算，呼出气包含： 78.14% N2，13.6%～16% O2，4.0%～5.3% CO2，5% 水汽，1 ppmv VOCs，1 ppmv氨气）; （2）不易爆炸，相对安全; （3）是实验室常用标准气体，易于获取。

当源内气体氛围为N2，充入流速分别为0.1和0.8 L/min时，丙酮检出强度增加约9倍， 信噪比（S/N）提高约2倍（表1），吲哚信号强度增加约6倍（表1）。值得注意的是，对比SESI源内未通入N2与N2通入流速为0.1 L/min时呼出气的检测结果，发现丙酮信号没有显著差别，而吲哚的信号增强约2倍，且信号重现性（RSD）得到改善，RSD由55%减小为10%。

与N2结果相似（表1，图5），CO2氛围下，当充入流速为0.8 L/min时，相比于0.1 L/min，丙酮和吲哚的信号强度分别提高約1倍和4倍; 对于Zero air，当充入流速为0.8 L/min 时，相比于0.1 L/min，丙酮和吲哚的信号强度分别提高约11倍和9倍。对比未通入CO2、Zero air与0.1 L/min 的CO2、Zero air氛围下呼出气的检测结果，发现丙酮和吲哚的信号均没有显著差别，且在这两种氛围气体下，呼出气中吲哚信号的重现性未得到显著改善。

综上，当以0.8 L/min的流速向源内充入N2、CO2和Zero air时，呼出气中吲哚及丙酮的检出强度均明显提高（图5）。

在纯净气体充入流速均为0.8 L/min的条件下，对呼出气中丙酮及吲哚的检出信号强度进行正态分布检验及方差齐性检验，结果满足单因素方差分析（ANOVA analysis）的条件。ANOVA结果（图6）表明，当显著性水平为0.05时，丙酮（Prob>F： 1.0 ×10 8; F Value 89.8）及吲哚（Prob>F： 3.7 ×10 5; F Value 23.1）在N2、CO2、Zero air气体氛围下的检出强度均存在显著性差异。丙酮在Zero air 氛围下的强度均值略高于N2氛围下的结果，CO2氛围下最低; 吲哚在N2氛围下的信号强度高于Zero air和CO2氛围下的结果。进一步对比3种纯净气体氛围两两之间的差异性，多重比较分析结果（图7）表明，在显著性水平为0.05时，呼出气中丙酮的信号在N2与CO2之间（Prob： 2.4 ×10 6，Sig=1）、CO2与Zero air之间（Prob： 0，Sig=1）及N2和Zero air之间（Prob： 3.3 ×10 4，Sig=1）均存在显著性差异; 呼出气中吲哚的信号在N2与CO2之间（Prob： 2.9 ×10 5，Sig=1）、N2和Zero air之间（Prob： 0.002，Sig=1）均存在显著性差异，而在CO2与Zero air之间（Prob： 0.1，Sig=0）不存在显著差异。呼出气中丙酮及吲哚的信号在N2和Zero air之间的差异显著性均最小，推测主要是由于Zero air的主要成分为N2（79%）。综上，为提高SESI-MS检测呼气中内源性VOCs的灵敏度，可在自制SESI源中通入N2。

3.3 SESI源内气体氛围对基质的影响

分析SESI源内气体氛围对基质的影响，结果表明，以N2氛围为例，当通入气体流速分别为0.1和0.8 L/min时，即当充入N2流速提高8倍时，PA和DP的信号强度分别减少约0.6和0.1倍（表2）。此结果与3.2节中呼出气中VOCs的检出情况相反，推测可能是SESI源内纯净气体含量增加后，基质在源内含量降低，进而检出强度降低。此外，N2通入流速为0.1 L/min时的结果与未通入N2的结果没有显著差别，表明此时源内N2含量还无法影响信号检出效果，此结论与呼出气中丙酮的检出结果一致（表1和表2）。

气体氛围为CO2和Zero air时，趋势与N2相似（表2，图8），当充入气体流速为0.8 L/min时，相比于0.1 L/min气体流速，PA和DP的信号强度分别减少约0.5和0.1倍。

值得注意的是，当实时检测呼气时，PA和DP信号强度，在N2、CO2气体氛围中，呈降低趋势，而在Zero air氛围中出现进样峰，本研究组将会在后续工作中进一步探究这一现象。

8; F Value 69.6）在3种气体氛围下检出信号稳定，且检出强度均存在显著性差异; 并且，在N2氛围下PA和DP的信号强度均低于Zero air和CO2氛围下的结果，说明N2氛围对降低背景基质干扰的影响最大。

进一步对比0.8 L/min流速下3种纯净气体氛围两两之间的差异性，结果（图10）表明，8，Sig=1）CO2与Zero air之间（Prob： 4.6 ×10 6， Sig=1）也均存在显著性差异。Zero air是造成PA及DP信号强度差异显著的主要原因。上述结果说明，N2氛围对于降低基质PA及DP干扰的效果最好，而Zero air氛围最差。

综上，自制SESI源内通入足够量的纯净N2，可以显著增强呼出气中丙酮及吲哚的信号强度，同时显著降低基质信号强度。此外，由于N2为惰性气体，性质稳定，不会对呼气装置有影响，不易与其它物质发生反应，因此适宜作为SESI-UHRMS检测呼出气时的SESI源内的气体氛围。

4 结 论

本研究结果表明，充入一定流速的纯净气体，可以增强提高呼出气中丙酮和吲哚的电离效率; 同时，源内纯净气体含量增加后，能有效降低源内PA和DA含量，进而降低基质检出强度。3种纯净气体氛围中，以N2对呼出气中丙酮和吲哚的增强效果以及对基质PA和DA的降低效果，最为显著。在后续研究中，还需以有效提高目标物的信噪比、降低基质干扰为目标，更系统、深入地探索气体氛围对呼出VOCs的影响机制，如通过加入不同气体体积比例N2和O2或N2和CO2混合气体，拓宽流速范围，以更好地理解气体氛围理化性质对电离效率的影响机制，为优化SESI源内气体氛围、研制SESI商品源、建立SESI-MS呼气检测方法提供理论依据。

References

1 Sinues P M L， Kohler M， Zenobi R. PloS One， 2013， 8（4）： e59909

2 Sinues P M L， Kohler M， Zenobi R. Anal. Chem.，  2013，  85（1）： 369-373

3 Bean H D， Zhu J J， Sengle J C， Hill J E. J. Breath. Res.，  2014，  8（4）： 041001

4 Garcia-Gomez D， Gaisl T， Bregy L， Sinues P M L， Kohler M， Zenobi R. Chem. Commun.，  2016，  52（55）： 8526-8528

5 Vidal-de-Miguel G， Macia M， Pinacho P， Blanco J. Anal. Chem.，  2012，  84（20）： 8475-8479

6 Li X， Huang D D， Du R， Zhang Z J， Chan C K， Huang Z X， Zhou Z. J. Vis. Exp.，  2018，  133： e56465

7 ZHU Teng-Gao， HAN Jing， SHU Jun-Wen， KE Mu-Fang， WANG Dan， LIU Wen-Jie， LIN Nian-Xiang， CHEN Huan-Wen. Chinese J.Anal.Chem.， 2018， 46（3）： 400-405

朱騰高， 韩 京， 舒俊文， 柯牡芳， 王 丹， 刘文杰， 林年香， 陈焕文. 分析化学， 2018， 46（3）： 400-405

8 Bean H D， Zhu J J， Hill J E. J. Vis. Exp.，  2011，  52： UNSP e2664

9 Fenn J B， Mann M， Meng C K， Wong S F， Whitehouse C M. Science，  1989，  246（4926）： 64-71

10 Wu C， Siems W F， Hill H H. Anal. Chem.，  2000，  72（2）： 396-403

11 Singh K D， del Miguel G V， Gaugg M T， Ibanez A J， Zenobi R， Kohler M， Frey U， Sinues P M L. J. Breath Res.，  2018，  12（2）： 027113

12 Gaugg M T， Gomez D G， Barrios-Collado C， Vidal-de-Miguel G， Kohler M， Zenobi R， Sinues P M L. J. Breath Res.，  2016，  10（1）： 016010

13 Bregy L， Muggler A R， Sinues P M L， Garcia-Gomez D， Suter Y， Belibasakis G N， Kohler M， Schmidlin P R， Zenobi R. Sci. Rep.，  2015，  5： 15163

14 Bean H D， Mellors T R， Zhu J J， Hill J E. J. Agric. Food Chem.，  2015，  63（17）： 4386-4392

15 Li X， Huang L， Zhu H， Zhou Z. Rapid Commun. Mass Spectrom.，  2017，  31（3）： 301-308

16 Keller B O， Sui J， Young A B， Whittal R M. Anal. Chim. Acta，  2008，  627（1）： 71-81

17 https：//www.waters.com/webassets/cms/support/docs/bkgrnd_ion_mstr_list.pdf

18 http：//www.newobjective.com/downloads/technotes/PV-3.pdf

19 Tirzite M， Bukovskis M， Strazda G， Jurka N， Taivans I. J. Breath Res.，  2017，  11（3）： 036009

20 Fu X A， Li M X， Knipp R J， Nantz M H， Bousamra M. Cancer Med.，  2014，  3（1）： 174-181

21 Oguma T， Nagaoka T， Kurahashi M， Kobayashi N， Yamamori S， Tsuji C， Takiguchi H， Niimi K， Tomomatsu H， Tomomatsu K， Hayama N， Aoki T， Urano T， Magatani K， Takeda S， Ade T， Asano K.PloS One，  2017，  12（4）： e0174802

22 Zhao J， Zhang R Y. Atmos. Environ.，  2004，  38（14）： 2177-2185

23 Szulejko J E， McMahon T B. J. Am. Chem. Soc.，  1993，  115（17）： 7839-7847

24 Benoit F M， Harrison A G. J. Am. Chem. Soc.，  1977，  99（12）： 3980-3984

25 Sinues P M L， de la Mora J F. Int. J. Mass Spectrom.，  2007，  265（1）： 68-72

26 Wu M X， Wang H Y， Zhang J T， Guo Y L. Anal. Chem.，  2016，  88（19）： 9547-9553