伍娜娜，荣 娜，康 超，刘 祥，陈 琛，陈春琳，丁 锐，吴三桥

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院/中德天然产物研究所，陕西 汉中 723001；2.陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心，陕西 汉中 723001)

大肠杆菌(Escherichiacoli)是一种条件致病菌[1]，也是一种人畜共患病原菌，可诱发人类腹泻、膀胱炎、败血症、胆囊炎、婴儿脑膜炎及养殖动物的乳房炎，尤其是奶牛和奶山羊乳房炎，给奶制品业造成巨大经济损失[2-4]。目前，抗生素是防治大肠杆菌感染的主要化学药物。然而，抗生素的滥用难免会造成细菌耐药性、药物残留和环境污染，对人和动物肠道菌群微生态平衡产生严重影响。因此，迫切需要深入研究其耐药机制，并开发新型疫苗来防治大肠杆菌的感染[5]。外膜蛋白A(Outer membrane protein A，OmpA)是阴性杆菌重要的外膜蛋白，其表达丰度高，在生物膜形成、宿主细胞的识别与侵袭、多重耐药等方面起着重要作用[6]。已有研究报道，OmpA是大肠杆菌感染发病机制中的主要毒力因子[7]，会导致动物的中枢神经系统、呼吸道和泌尿生殖系统等疾病[8]。OmpA具有较强的免疫原性[8]，能够诱导宿主的先天和过继免疫应答[9]。VAIPHEI等[10]报道，OmpA可促进细菌黏附到哺乳动物细胞。HSIEH等[2]用特异性重组OmpA蛋白免疫小鼠，发现OmpA可以调节细胞因子、趋化因子、一氧化氮合酶和环氧合酶-2的表达，从而保护小鼠免受大肠杆菌脑内感染引起的死亡。GUAN等[6]评估OmpA抗血清对大肠杆菌感染的潜在免疫保护作用，在小鼠模型中进行了活性保护试验，结果表明，重组OmpA蛋白接种的小鼠在大肠杆菌CVCC 1515攻击时能够受到良好的保护。RAINARD等[3]用纯化的重组OmpA蛋白进行免疫诱导，能够使奶牛抗体效价双对数增加，表明重组OmpA蛋白是诱导奶牛产生抗体的良好免疫原。GU等[1]通过对小鼠进行免疫发现，OmpA特异性抗体能够介导吞噬调理作用并抑制细菌入侵，从而给被大肠杆菌攻击的小鼠预防性保护。目前，对大肠杆菌OmpA的致病和免疫作用已有一定了解，但仍未开发出预防大肠杆菌感染的候选疫苗。因此，本研究利用生物信息学方法对大肠杆菌OmpA进行系统进化及理化性质分析，并从疫苗的研制方向——表位疫苗角度，采用表位疫苗设计方法获得重组优势表位多肽，进一步提高大肠杆菌OmpA免疫效果，为大肠杆菌OmpA表位疫苗开发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

选取由NCBI数据库公布的大肠杆菌外膜蛋白OmpA序列(登录号NP_415477.1)，共含346个氨基酸，序列如下：MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAPKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFINNNGPTHENQLGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGSVENGAYKAQGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADTKSNVYGKNHDTGVSPVFAGGVEYAITPEIATRLEYQWTNNIGDAHTIGTRPDNGMLSLGVSYRFGQGEAAPVVAPAPAPAPEVQTKHFTLKSDVLFNFNKATLKPEGQAALDQLYSQLSNLDPKDGSVVVLGYTDRIGSDAYNQGLSERRAQSVVDYLISKGIPADKISARGMGESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLAPDRRVEIEVKGIKDVVTQPQA。

1.2 方法

1.2.1 进化关系预测 通过DNAMAN 8.0将NCBI数据库中不同菌株OmpA的氨基酸序列进行同源性分析，利用MEGA 5.0对不同菌株的OmpA构建系统发育树。

1.2.2 理化性质预测 采用ExPASy-ProtParam预测分析OmpA蛋白的亲水性、等电点、半衰期、稳定性，从ProtScale Analysis数据库获得OmpA蛋白的亲水性图谱。

1.2.3 信号肽、跨膜结构与高级结构预测 使用Signal P 4.1软件预测OmpA的信号肽，利用TMHMM Serverv.2.0进行OmpA的跨膜结构分析。应用SOPMA和SWISS-MODEL在线预测软件，分别对OmpA的二级结构和三级结构进行预测。

1.2.4 蛋白质互作网络分析 采用生物信息学String软件对OmpA与其他蛋白质的互作关系网络进行预测。

1.2.5 细胞表位预测 分别采取BepiPred 1.0和ABCpred共2种方案对OmpA的B细胞表位进行预测，获得其优势肽段。利用神经网络法CTLpred和MHC-Ⅱ类分子结合肽在线预测程序Peptide对CTL细胞抗原表位和Th细胞抗原表位进行预测。

1.2.6 串联表位重组分析 为了选出抗原性较好的组合，并将其作为多表位疫苗的最优氨基酸序列，将获得的3种抗原表位中的优势表位依次进行编号，在相邻细胞表位间用甘氨酸(GGGG)进行拼接，再利用DNASTAR.Lasergene.v 7.1对获得的表位肽段进行不同排序优化，将最优组合翻译为核苷酸序列，获得最终的重组表位多肽。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌OmpA的同源性与系统发生分析

通过DNAMAN 8.0软件进行不同菌株OmpA的氨基酸序列同源性分析可知，不同菌属间OmpA的氨基酸序列同源性较差(图1)。采取MEGA 5.0构建系统进化树，结果如图2所示，大肠杆菌与阪崎肠杆菌、肠炎沙门氏菌间进化关系较近，OmpA免疫动物产生的特异性与非特异性抗体，可能为不同种肠道细菌的感染提供交叉免疫保护作用。

图1 OmpA氨基酸序列的多重比对Fig.1 Multiple alignment of amino acid sequences of OmpA

2.2 大肠杆菌OmpA理化性质分析

由OmpA理化性质预测结果可知，OmpA分子质量为37.2 ku，理论等电点为5.99，脂肪指数为77.28；不稳定指数为21.44，属于稳定蛋白质；OmpA的分子式为C1 652H2 565N455O509S8；半衰期大于10 h；OmpA的平均亲水性为-0.339，氨基酸分值最小为-2.600，最大为2.889，表明其为亲水性蛋白质(图3)。

2.3 大肠杆菌OmpA的信号肽与跨膜结构预测

由OmpA信号肽预测结果可知，该蛋白质的信号肽序列由N端的21个氨基酸残基组成，切割位点在21—22个氨基酸残基之间(图4)。由OmpA跨膜结构预测结果可知，7—29位氨基酸间形成一个可信度较高的跨膜结构(图5)。

图2 OmpA氨基酸序列系统进化分析

图3 大肠杆菌OmpA的亲水性预测

图4 大肠杆菌OmpA的信号肽分析

图5 大肠杆菌OmpA跨膜区分析Fig.5 Transmembrane domain prediction of Escherichia coli OmpA

2.4 大肠杆菌OmpA的二级结构和三级结构分析

SOPMA软件分析OmpA的二级结构可信度为82.00%，α-螺旋占比例为31.79%、β-转角占6.36%、β-片层和无规则卷曲分别占16.18%和45.66%(图6)，无规则卷曲处存在抗原表位的可能性较大，为细胞抗原表位的产生奠定了一定基础。使用SWISS-MODEL在线预测软件模拟,OmpA的三维空间结构为桶状结构(图7)。

2.5 大肠杆菌OmpA的蛋白质互作网络分析

通过String方法预测大肠杆菌OmpA的蛋白质互作网络可知，大肠杆菌OmpA与10种蛋白质存在相互作用，其中par和coa这2种蛋白质与OmpA的作用相对更紧密(图8)。

c:无规则卷曲; e:β-片层; h:α-螺旋; t:β-转角

图7 大肠杆菌OmpA的三级结构预测Fig.7 Prediction of tertiary structure of Escherichia coli OmpA

2.6 大肠杆菌OmpA的B细胞表位分析

通过ABCpred和BepiPred 1.0共2种方法预测OmpA的B细胞表位可知，获得B细胞抗原优势表位有4段，分别为第44—50位、第83—95位、第126—135位、第298—313位(表1和表2)。

图8 大肠杆菌OmpA的蛋白质互作预测Fig.8 Protein-protein interaction prediction of Escherichia coli OmpA

表1 ABCpred预测的大肠杆菌OmpA的B细胞表位肽段位置

表2 BepiPred 1.0预测的大肠杆菌OmpA的B细胞表位肽段位置Tab.2 Prediction of B cell epitopes of Escherichia coli OmpA by BepiPred 1.0 method

2.7 大肠杆菌OmpA的T细胞抗原表位预测

2.7.1 大肠杆菌OmpA的CTL细胞抗原表位预测 通过神经网络法CTLpred对OmpA的CTL细胞抗原表位进行预测，选取5种不同结合肽类型，综合相同抗原表位序列，分析得到OmpA的CTL细胞抗原表位为第237—245位的ALDQLYSQL(表3)。

表3 大肠杆菌OmpA的CTL细胞抗原表位预测Tab.3 The CTL epitopes prediction of Escherichia coli OmpA

2.7.2 大肠杆菌OmpA的Th细胞抗原表位预测 采用Peptide预测OmpA的Th细胞抗原表位，选用3种不同多肽类型，根据共有肽段，得到第284—292位的YLISKGIPA为OmpA的Th细胞抗原表位(表4)。

表4 大肠杆菌OmpA的Th细胞抗原表位预测Tab.4 The Th epitopes prediction of Escherichia coli OmpA

2.8 大肠杆菌OmpA重组串联抗原表位分子设计

为得到大肠杆菌OmpA序列抗原性较好的串联表位，将获得的B、T细胞抗原表位进行编号，用甘氨酸(GGGG)作为2个相邻表位间的柔性片段，然后用DNASTAR.Lasergene.v 7.1软件将B细胞抗原表位编号为1—4，CTL细胞抗原表位编号为5，Th细胞抗原表位编号为6，分析不同排列组合并对其进行优化，选取最佳顺序：5—4—1—6—3—2(图9)。转化成氨基酸序列：ALDQLYSQLGGGGRGMGESNPVTGNTCDNGGGGFINNNGPGGGGYLISKGIPAGGGGDTKSNVYGKNGGGGPYKGSVENGAYKA(下划线为柔性片段)。翻译成核苷酸序列：GTCGTCAGTGATTGGGTAACCCAGTTTGGTGGCGGTGGCCGGGCCATTGTTGTTGATGAAACCAGTGTCATGGTACTGGGACCAGCCGGTGGCGGTGGCGTTGGATTCGCCCATACCACGGGTGGCGGTGGCGTAACCACCAAAAGCACCAGCGCCCAGGGTGGCGGTGGCCAGAACGTCAGACTTCAGAGTGAAGTGCTTGGTGGCGGTGGCACCGATGCGGTCGGTGTAACCCAGAACAACTACGGAACC(下划线为柔性片段核苷酸序列)。

图9 大肠杆菌OmpA重组多肽抗原指数分析Fig.9 Antigenic index of Escherichia coli OmpA recombination polypeptide

3 结论与讨论

生物信息学分析目前在基因序列比对、蛋白质结构与功能分析方面应用较多，它能够准确预测蛋白质的抗原表位，并降低试验盲目性，提高工作效率，在疫苗研制方面应用广泛[11-12]。

本研究采用生物信息学分析方法对大肠杆菌OmpA进行蛋白质互作关系、理化性质、二级结构和三级结构、B细胞和T细胞抗原表位分析，发现该蛋白质为亲水性蛋白质，有跨膜结构，存在信号肽序列。大肠杆菌OmpA的二级结构中以无规则卷曲为主(45.66%)，而无规则卷曲结构易形成盘旋、扭曲，暴露在蛋白质外层，成为优势细胞抗原表位的可能性较大，为抗原表位的产生打下基础[11,13]。

抗原表位根据受体差异可分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。近年来发展出多种预测方法，例如机器学习算法，它主要包括支持向量机器(SVMHC)、隐马尔可夫模型(HMM)和人工神经网络(ANN)等，随后也相继出现了计算机软件和网络服务器(基于矩阵方法和基于人工神经网络预测方法)等方法来预测细胞表位[14]。依据蛋白质B细胞抗原表位的预测计算方法，开发出的一些在线预测软件使用便捷，预测结果较为准确。常用的B细胞抗原表位在线预测方法有DNASTAR、PREDITOP、PEOPLE、BEPITOPE、COBEpro、BepiPred和ABCpred等[11,14-15]。其中，BepiPred主要进行线性表位的预测[11]，而ABCpred的预测结果准确率较高[16]。同时使用这2种方法，能够进一步提高预测的准确性，因此，本研究选择这2种方案对OmpA的B细胞抗原表位进行预测，并结合其二级结构分析结果，最终获得OmpA的B细胞抗原表位肽段的位置为第44—50位、第83—95位、第126—135位、第298—313位。

CTL细胞抗原表位是抗原中能与MHC-Ⅰ类分子结合后激活CTL细胞免疫的短肽，常见的预测方法包含IEDB、SYFPEITHI、SYFPEPI、BIMAS、IMTECH、CTLpred、NetCTL和NetMHC等，在肿瘤、病毒、细菌和寄生虫的CTL细胞抗原表位预测上均有应用[14-18]。刘娜等[15]采取SYFPEPI、BIMAS和NetCTL方法分析结核分枝杆菌α晶体蛋白(Rv2031c)，获得3个优势CTL细胞抗原表位，这些表位可能激起机体对病原菌的免疫应答反应；刘祥等[16]利用神经网络与量化矩阵法预测，GP5、CAP与E2蛋白各具有1个CTL细胞抗原表位，这对蛋白质优势抗原表位的筛选有重要意义。本研究采用神经网络法对OmpA的CTL细胞抗原表位分析，结果得到该蛋白质的CTL细胞抗原表位为第237—245位的ALDQLYSQL。

Th细胞抗原表位是抗原中能与MHC-Ⅱ类分子结合，并经抗原呈递后可激活机体免疫反应的短肽，该表位预测在细菌蛋白质和病毒蛋白质上均有研究[16-17]。于娟等[18]用SYFPEITHI软件预测H9N2禽流感病毒的HA蛋白中含有6个Th细胞抗原表位，推测其可能诱导机体发生特异性细胞免疫和体液免疫。本研究通过选取3类不同等位基因的Th细胞抗原表位进行分析，获得OmpA的Th细胞抗原表位区段为第284—292位的YLISKGIPA，这为串联表位疫苗的设计提供了理论依据。

表位疫苗是一种可同时携带多个抗原表位及辅助性表位的疫苗，安全性好、易操作且可控[19]，在口蹄疫病毒[20]、乙型脑炎病毒[13]、幽门螺旋杆菌[21]、埃博拉病毒[22]及人类免疫缺陷病毒1型[23]等病原菌上均有报道。本研究预测，大肠杆菌OmpA可能有4个优势B细胞抗原表位、1个CTL细胞抗原表位、1个Th细胞抗原表位，并重组获得了抗原性较好的重组多肽，为OmpA蛋白表位疫苗的开发提供了依据。