袁秀平,王云云,袁向辉

(杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100)

柿叶为柿科植物柿(Diospyros kaki L.)的新鲜或干燥叶。柿叶中含有黄酮、鞣质、酚类、香豆素类、挥发油、有机酸以及丰富的维生素C等多种物质[1〗，其中黄酮类化合物是柿叶提取物的主要有效成分，诸如芦丁、黄芪甙、紫云苷、槲皮素、金丝桃甙等，黄酮类化合物具有降脂、抗血栓、抗氧化、抗衰老、清除自由基等多种药理活性[2～3],可应用于医药、食品、保健品以及化妆品等行业，具有极广的开发应用前景。柿叶黄酮的提取方法有双水相萃取法[4]、超声波提取法[5～7]、大孔树脂分离法[8]、微波提取法[6]、纤维素酶提取法[9～10]以及超临界萃取法[11]等，复合酶酶解作用对沙棘和冬枣叶总黄酮提取率均有促进作用[12～13]，但利用复合酶提取柿叶黄酮的工艺研究尚未见报道，以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为提取溶剂探索了植物提取专用复合酶在柿叶总黄酮提取中的作用，考察酶解提取条件对总黄酮提取率的影响，优化提取工艺，为柿叶的深度开发和综合利用提供技术支持和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柿叶：2018年7月采自杨凌职业技术学院西校区校园内柿树，柿叶采摘清洗后自然风干，在恒温干燥箱烘至恒重，其烘制温度设为60℃ ，时间为3h，用万能粉碎机将烘干的样品磨碎，过50目筛备用。

试剂：芦丁标准品(UV≥98%)，江西佰草源生物科技有限公司；纤维素酶(50 000 IU·g-1)、植物提取专用复合酶(20 000 IU·g-1)，河北格贝达生物科技有限公司；无水乙醇，亚硝酸钠(NaNO2)、九水合硝酸铝(Al(NO3)3· 9H2O)、氢氧化钠(NaOH)、柠檬酸(C4H2O7· H2O)、磷酸氢二钠(Na2HPO4· 2H2O)均为分析纯。

1.2 仪器与设备

101-3AB型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；150B摇摆式高速中药粉碎机，浙江瑞安市永历制药机械有限公司；FA2004型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DZKW型电热恒温水浴锅，天津市大港区红杉实验设备厂；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵，郑州科丰仪器设备有限公司；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线绘制 准确称取芦丁标准品10.05 mg，用60% 乙醇溶解后定容至50 mL容量瓶中，作为标准品原液。分别准确量取芦丁标准原液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，先加5% NaNO2溶液1.0 mL，5分钟后加l0% Al( NO3)3 溶液1.0 mL，再5分钟后加4% NaOH溶液10 mL，用60%乙醇定容，15 min后，在510 nm波长下测定吸光度，作芦丁浓度-吸光度标准曲线，得回归方程为 A =0.0091C+0.0041，R2=0.9996。

1.3.2 酶解法提取单因素影响试验 粉碎过筛的柿叶粉末为样品，使用磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液作为提取溶剂，选择生物酶种类、酶用量、缓冲液pH、酶解温度和酶解提取时间五个因素，采用固定其它因素，考察单一因素对柿叶黄酮提取率影响的方式顺次进行单因素筛选试验。具体操作方法是：准确称取柿叶粉1. 00 g 于具塞三角瓶中，加20 mL缓冲液，添加生物酶，在合适温度水浴条件下酶解一定时间后加25 mL无水乙醇，抽滤，用60%乙醇定容于50 mL，作为待测样液。

图1 芦丁标准曲线

1.3.3 正交试验法优化提取工艺 综合单因素试验结果的分析，选择对柿叶黄酮提取率影响较大的因素水平进行正交试验设计，优化酶解法提取柿叶总黄酮的工艺，优选出提取最适条件。

1.3.4 柿叶中总黄酮含量测定和计算 量取样品待测液 1.0 mL于 25 mL容量瓶中，按1.3.1中方法操作，将所得吸光度代入标准曲线回归方程，计算得提取液中总黄酮含量。按下列公式计算出总黄酮含量和黄酮提取率：黄酮含量( mg·g-1) = C×25×50 /1 000 W，黄酮提取率/ %= (黄酮含量/1 000)×100%，式中，C为从回归方程求得的芦丁浓度(mg·L-1) ，25、50为稀释倍数，W为柿叶重(g)。

2 结果与分析

2.1 酶解法提取柿叶总黄酮的单因素影响试验

2.1.1 生物酶种类和用量的影响 试验中固定提取溶剂为pH4.8的缓冲液，40℃水浴，酶解提取时间为60 min，分别考察纤维素酶和复合酶用量为0、20、40、60、80、100 mg的影响。生物酶种类和用量对柿叶总黄酮提取率影响见图2。

图2 酶用量对柿叶总黄酮提取率的影响

由图2可明显看出，添加生物酶可提高黄酮提取率，且相同用量的复合酶比单一纤维素酶提取率高，可能是因为复合酶由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和β-葡聚糖酶四种酶组成，生物酶之间可发挥协同促进作用。复合酶用量在6%时，提取率明显升高，之后的增涨幅度非常小；纤维素酶随着用量的增加，黄酮提取率呈递增趋势，但是总体提取率仍低于复合酶。

2.1.2 缓冲液pH的影响试验 试验时分别添加纤维素酶和复合酶用量固定为60 mg，40℃水浴，酶解提取时间为60 min，考察提取溶剂缓冲液pH值为4.2、4.8、5.4、6.0、6.6、7.2的影响。缓冲液pH对柿叶总黄酮提取率影响见图3。

图3 缓冲液pH对柿叶总黄酮提取率的影响

图3可知，缓冲液pH值的大小对于柿叶总黄酮的提取率影响较大，复合酶在pH5.4～6.0左右黄酮提取率达到5.6%以上，而纤维素酶在pH5.4时，黄酮提取率达最高值5.2%，但还是低于复合酶的促进作用。当pH超过6.0后，两种酶的促进作用均明显下降，几乎失去生物酶的促进作用。可能是由于复合酶中其它组分的原因，其最适pH和纤维素酶的有差异，但表现出缓冲液pH在4.8～6.0的范围内，酶解法提取黄酮率较高。

2.1.3 酶解温度的影响试验 试验中固定添加了60 mg复合酶，pH6.0的缓冲液作为提取溶剂，分别在30、40、50、60、70℃水浴条件下酶解60 min。酶解提取温度对黄酮提取率的影响见图4。

图4 温度对柿叶总黄酮提取率的影响

图4中得知，随着温度升高，总黄酮的提取率随之升高，当温度达到 50℃ 时，总黄酮提取率达到5.7%，继续升温，总黄酮的提取率急剧下降。可能是因为随温度升高，酶活性逐渐增大，提取率升高; 当温度超过60℃时，酶逐渐失活，总黄酮提取率降低，70℃时，完全丧失酶的活性，黄酮提取率甚至低于不加酶的对照组。

2.1.4 酶解时间的影响试验 试验中添加了60mg复合酶，pH6.0的缓冲液作为提取溶剂，水浴温度50℃条件下，考察酶解提取时间30、60、120和240min时的黄酮提取率，酶解提取时间对柿叶黄酮提取率的影响见图5。

由图5 可见，酶解提取刚开始阶段，黄酮提取率随时间延长呈增长趋势，1 h后，黄酮含量增长幅度变小，2 h后几乎不再增长，说明酶的活性发挥主要是在60～120 min之间，再延长提取时间反而会影响黄酮提取的纯度和组分。

图5 酶解提取时间对柿叶总黄酮提取率的影响

2.2 正交试验优化提取工艺

依据单因素试验结果，以柿叶黄酮提取率为考察指标，选取酶解提取温度(A)、缓冲液pH值(B)、添加复合酶量(C)和酶解提取时间(D)四因素三水平，按L9(34)设计正交试验(见表1)。

表1 正交试验因素水平设计

从正交试验结果分析(表2)看出，影响因素的主次顺序为：pH值>提取温度>提取时间>酶用量，复合酶辅助提取柿叶总黄酮的最佳工艺条件为为A3B2C2D2，但是该组合并未出现在正交试验组中，因此进行了验证试验，并设不加酶的空白对照。结果显示，在最优组合条件下，柿叶总黄酮提取率为6.02%，而对照组的黄酮提取率为4.41%。

表2 正交试验设计及结果分析

3 结论

在单因素试验研究基础上，进行正交优化工艺，结果表明添加复合酶比单一的纤维素酶更有助于提高柿叶黄酮的提取率。酶解法提取柿叶黄酮的最佳提取条件是：pH5.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为提取溶剂、复合酶用量为70 mg·g-1、提取温度为45℃恒温水浴、提取时间90 min，在该条件下，柿叶黄酮提取率达6.02%，比不加酶的对照组提高了36.5%。 此法具有成本低，得率高的优势，可为柿叶总黄酮的提取工艺研究和优化提供参考价值。