舒加乐 郑琳琳

摘要：利用同源重组的原理构建了单增李斯特氏菌NrdD基因插入突变株，从大肠杆菌基因组中分别扩增出NrdD基因上下游同源臂，与pKSV7质粒相连，构建成功重组突变载体pKSV7-D1D2，将其电转入单增李斯特菌后，用氯霉素抗性平板筛选得到NrdD基因插入突变株，并对突变菌株序列测定，证明回复突变株构建成功。该突变株可在严格无氧环境中生存，为进一步研究NrdD基因功能、单增李斯特的致病机制和疫苗载体的研发奠定了基础。

关键词：单增李斯特菌;NrdD基因;突变株;同源重组

中图分类号：R392.11        文献标识码：A        文章编号：1007-273X（2019）05-0005-02

李斯特菌病是由单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）引起的一种人兽共患病，能够引起人、羊、猪等动物疾病。人感染后能引发脑膜炎、发热性败血性胃肠炎等临床症状，感染后发病死亡率约为25%。单增李斯特氏菌为一种革兰氏阳性、兼性厌氧胞内寄生菌，但无法在严格的无氧条件下生长，广泛寄生于肉类、蛋类、海产品、乳制品和蔬菜细胞内，己被世界卫生组织列为四大食源性致病菌之一[1]。因此研制预防李斯特菌病的疫苗迫在眉睫。但因其特殊的寄生定殖方式导致其疫苗的开发比较缓慢，构建能在动物肠道等无氧环境中生存的突变菌株可作为减毒细菌疫苗载体，给研制口服疫苗提供重要的基础，这对动物疫病的预防和控制有重要意义。

NrdD基因是大肠杆菌在厌氧环境中高度表达的一种基因，现已被证实能够调节细菌在无氧环境中的代谢途径[2]。有报道称LM的标准株EGD-e基因组中无NrdD基因，因此在肠道内的存活率不高，导致其滞留时间短，不能快速有效地产生免疫反应[3]。

LM作为致死率极高的胞内寄生菌，能经受高温烹饪、胃部强酸环境等逆境后随食物到达肠道。随后LM通过内化作用进入肠道上皮细胞或吞噬细胞，在宿主细胞内和细胞间进行增殖，再随淋巴系统和血液循环系统到达胎盘和大脑，引起孕妇流产或脑膜炎、败血症等临床症状，严重的可造成肝和脾的脓肿以及局部坏死。LM独特的致病机制使其具备了作为疫苗载体的优秀潜质[4]。如果将单增李斯特菌做减毒处理，将其作为载体转入肿瘤抗原等制成的肿瘤疫苗，就可以起到激发细胞免疫特异杀伤肿瘤细胞的作用。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌株与质粒  单增李斯特菌减毒株LM1003（以EGD-e为模板）;穿梭载体pKSV7;克隆载体pMD18-T。

1.1.2  主要试剂  rTaq DNA聚合酶、dNTP等;基因组DNA提取试剂盒，DNA琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒，质粒抽提试剂盒，限制性内切酶SalI，BamHI，T4 DNA连接酶;氨苄青霉素，氯霉素，卡那霉素;BHI培养基。

1.1.3  引物及测序  引物根据NCBI序列（ID：948755）设计（表1）。

1.2  方法

1.2.1  质粒构建  将减毒株LM1003（actA/plcB双缺失）菌落接种于BHI液体培养基中，37 ℃摇床振荡培养16 h。取5 mL菌液离心后提取LM1003全基因组。取2μL基因组DNA为模板，扩增NrdD基因上下游序列。将扩增得到的两个片段进行酶切，连接后，转入克隆载体pMD-18T中。将连接产物pMD-18T-D1、pMD-18T-D2转入DH5α感受态细胞中，在含氨苄青霉素的LB平板生长即表示转入成功，并用PCR验证。

1.2.2  重组质粒pKSV7-D1D2的构建  从验证后的pMD-18T-D1D2质粒中扩增D1D2片段，基因片段回收后，分别将D1D2片段和pKSV7穿梭载体质粒双酶切，连接后转入DH5α感受态细胞中，涂氨苄青霉素抗性平板，进行PCR鉴定后送公司测序。

1.2.3  电转  将重组穿梭质粒pKSV7-ΔD1D2电转到单增李斯特菌中，涂在含氯霉素的BHI平板上，置于30 ℃培养箱中培养至平板上长出单菌落。

1.2.4  NrdD插入突变菌株的筛选  挑取氯霉素平板上的单菌落接种于BHI培养基中培养，做菌液PCR鉴定。将阳性菌落接种于BHI培养基中传代，每12 h传代1次。含氯霉素抗性的37 ℃传5代，无抗性的41 ℃传5代，将末次传代菌液进行平板划线（含氯霉素）筛选1代，挑取平板上的单菌落接种于37 ℃无抗性传5代，41 ℃无抗性传5代，将末次传代菌液进行平板划线（含氯霉素）筛选1代，以使基因发生同源重组，将末次培养产物进行氯霉素抗性板划线和无抗性板划线培养，得到在抗性板上不生长在无抗性板上生长的单菌落，即为疑似NrdD插入突变菌株，最终通过PCR和序列测定验证NrdD是否插入突变成功。

1.2.5  NrdD回复菌株的鉴定-细菌RNA的抽提和RT-PCR  将LM1003和LM1025单个菌落接种于BHI液体培养基中培养过夜后收集于1.5 mL离心管中。提取RNA，RT-PCR检测NrdD基因是否成功表达。

2  结果与分析

2.1  插入突变菌株的构建及筛选

将构建好的pKSV7-D1D2重组载体电转入单增李斯特菌LM1003后，将含有重组载体的菌落进行氯霉素和温度筛选。菌落PCR鉴定结果见图1。

2.2  pKSV7-D1D2序列验证

将阳性的pKSV7-D1D2克隆重新接种含有氨苄青霉素的LB培养基，37 ℃培养过夜，抽提质粒，取10 μL质粒测序。图2为在NCBI序列对比图，图3为峰图。确认pKSV7-D1D2序列正确。

3  小结与讨论

基因敲除不仅是研究基因功能的重要分子生物学手段，也是制备减毒疫苗的重要策略之一，对毒力基因的敲除可以大大加快减毒疫苗的研发速度。本研究构建了既能在大肠艾希氏菌表达又能在单增李斯特菌表达的穿梭载体质粒，利用生物体内的同源重组及抗生素抗性和温度筛选得到了单增李斯特菌的NrdD基因插入突变菌株，并且通过PCR和序列测定验证NrdD插入突变成功，为基因功能的研究和减毒疫苗的研发奠定了一定的基础。

参考文献：

[1] 李云霞，陈雯雯，顾晨荣，等.单增李斯特菌的检测方法研究进展[J].上海师范大学学报（自然科学版），2015（6）：687-693.

[2] SUN X，HARDER J，KROOK M，et al.A possible glycine radical in anaerobic ribonucleotide reductase from Escherichia coli：nucleotide sequence of the cloned nrdD gene[J].National academy of sciences，1993，90（2）：577-581.

[3] OFER A，KREFT J，LOGAN D T，et al.Implications of the inability of Listeria monocytogenes EGD-e to grow anaerobically due to a deletion in the class III NrdD ribonucleotide reductase for its use as a model laboratory strain.[J].Journal of bacteriology，2011，193（12）：2931-2940.

[4] 周  云，潘  蕾，郝春秋，等.單增李斯特菌作为疫苗载体的研究进展[J].中国免疫学杂志，2011（12）：1132-1134.