邱昊田, 郑宁宁, 方权辉, 林梅英, 周孙英(福建医科大学药学院,福建 福州 350122)

邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(di(2-ethylhexyl)phathalate,DEHP)作为广泛使用的增塑剂,存在于聚乙烯塑料、橡胶、食品包装材料、医用血袋和胶管、儿童玩具、清洁剂和日常护理用品中,可以通过多种途径迁移至食品中[1,2]。DEHP也是一种环境内分泌干扰物,若在人体内长期累积会引发激素失调[3,4]。由于DEHP在样品中的含量往往很低以及复杂基体的干扰,所以检测前需对样品进行有效的富集和除杂。液-液萃取、固相萃取(solid phase extraction,SPE)是最广泛应用的样品前处理方法,但也存在低选择性、低容量和消耗较多有机溶剂等缺点。因此,不断开发高选择性、高效率的萃取材料具有重要的研究意义。

本文以另一种方法合成了一种GO-MAA-MIP,具有较高的吸附容量和选择性,并建立了一种MIP-SPE-HPLC检测DEHP的方法。在GO的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)溶液中,以DEHP为模板分子、MAA为功能单体,采用沉淀聚合法合成具有分子印迹功能的GO复合材料GO-MAA-MIP,并将材料应用于牛奶塑料包装袋中DEHP的萃取,联用HPLC进行检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津制作所);Ultimate®XB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,月旭科技(上海)股份有限公司);Tecnai G2 F20场发射透射电子显微镜(TEM,美国FEI公司);Avatar 330 FT-IR红外光谱仪(德国Thermo Nicolet公司);DF-101 S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司);Neofuge 23R高速离心机(力康发展(香港)有限公司);DZF-6050真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);水浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司);HSC-24A氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)。

过氧化氢(30%,质量分数,下同)、乙醇(95%)、浓硫酸(98%)、磷酸(85%)、高锰酸钾(99.5%)、DMF(99.5%)、MAA(98%)、偶氮异丁腈(2,2-azobisisobutyronitrile,AIBN,99%)、DEHP(99%)、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate,DEP,99%)、邻苯二甲酸丁二酯(dibuty phthalate,DBP,99%)、邻苯二甲酸二戊酯(diamyl phthalate,DAP,99%)、正己烷(97%)均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司);甲醇(色谱纯,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司);乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene dimethacrylate,EDMA,分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);石墨粉(98%,北京百灵威科技有限公司)。本地某品牌塑料袋装牛奶购于校园超市。

1.2 实验过程

1.2.1GO的制备

在Hummers法[20]的基础上进行改进,步骤如下:配制9∶1(v/v)的浓硫酸-浓磷酸200 mL,冰浴下缓慢加入1.5 g石墨粉,搅拌混匀,在30 min内分次加入9 g高锰酸钾。继续冰浴下反应4 h,温度升至35 ℃反应1 h,升温至50 ℃继续反应36 h。加冰水使温度降为0～15 ℃,滴加30%的过氧化氢至溶液变为亮黄色。以6 000 r/min的速度离心30 min,沉淀经过水洗、丙酮沉淀、离心,重复多次直至呈中性。于50 ℃真空干燥3 h,得GO。

1.2.2石墨烯表面分子印迹材料的制备

印迹材料GO-MAA-MIP的合成:称取0.45 g (1.16 mmol)DEHP、0.60 g (6.97 mmol)MAA,溶于10 mL DMF中,超声脱气10 min,静置5 h。称取0.12 g GO于250 mL圆底烧瓶中,加入110 mL DMF,超声4 h,使GO分散于溶剂中。加入DEHP和MAA混合液,加入2.40 g交联剂EDMA,超声15 min,加入0.08 g AIBN。磁力搅拌,于70 ℃恒温水浴中反应24 h,制得黑色固体。用甲醇-乙酸(9∶1,v/v)回流12 h,乙醇反复洗涤呈中性,真空干燥后得到GO-MAA-MIP。

非印迹聚合物(non-molecularly imprinted polymer,NIP)GO-MAA-NIP的合成:不加模板分子,其他与制备GO-MAA-MIP方法相同。

印迹聚合物MAA-MIP的合成:不加GO,其他与制备GO-MAA-MIP方法相同。

1.2.3材料的表征

MAA-MIP、GO-MAA-MIP、GO分别与KBr固体压片做红外光谱图。通过TEM观察材料的微观形貌。

1.2.4溶液的吸附

称取10 mg GO-MAA-MIP于15 mL离心管中,用5 mL甲醇活化材料30 min,氮气吹干。加入10 mL含有一定浓度DEHP(或DEP、DBP、DAP)的甲醇-水(60∶40,v/v)溶液,每个浓度准备3份平行样。放入恒温振荡器中,于30 ℃振荡120 min,以6 000 r/min的速度离心15 min,取上清液,经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤,用HPLC检测。按公式(1)计算吸附量Q。平行做GO-MAA-NIP和MAA-MIP对照实验。

(1)

其中Q为聚合物的吸附量(mg/g);C0为吸附前溶液的浓度(mg/L);Ce为吸附后溶液的浓度(mg/L);V为样品溶液的体积(L);m为吸附剂的质量(mg)。

1.2.5实际样品前处理和萃取

参照国家标准[21],将牛奶塑料包装袋清冼干净,剪碎烘干,称取2 g包装袋,置于具塞锥形瓶中,加入20 mL正己烷,超声提取30 min,量取10 mL提取液,用氮气吹干,用10 mL甲醇-水(60∶40,v/v)溶液溶解,加入10 mg活化后的GO-MAA-MIP,于30 ℃振荡120 min,以6 000 r/min的速度离心15 min,去上清液,用10%(体积分数)的甲醇-水溶液涡旋1 min洗涤,以6 000 r/min的速度离心15 min,烘干,用1 mL甲醇-乙酸(9∶1,v/v)溶液振荡45 min,以6 000 r/min的速度离心15 min,取上清。重复1次,合并洗脱液,经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤,HPLC检测。

1.2.6HPLC条件

Ultimate®XB-C18色谱柱,柱温为30 ℃,进样体积为10 μL,流动相为甲醇-水(95∶5,v/v),流速为1.0 mL/min,紫外检测波长为226 nm。

2 结果与讨论

2.1 制备条件的优化

GO具有大的比表面积、强的吸附能力以及表面的含氧极性基团,能够吸附预聚体于其表面,在引发剂作用后,聚合反应在GO表面发生,随着聚合物分子链逐渐增长,GO-MAA的复合物从溶剂中沉淀下来。洗脱模板分子,得到表面分子印迹材料。

分别将GO分散于几种不同的有机溶剂中,超声4 h后过滤,试验结果表明,GO分散于甲醇、乙醇和乙腈中的质量浓度为300～500 mg/L,在DMF中的质量浓度约为1 000 mg/L。分别以甲醇、乙腈、DMF为溶剂合成3种GO-MAA-MIP,结果发现,在相同投料比例下,以甲醇或乙腈为溶剂时,得到的聚合物为灰色粉末,因其分散性较小,体系中GO含量较少,其中部分单体(MAA、EDMA)自聚合,不能与GO有效共聚;以DMF为溶剂合成的产品为黑色粉末,GO在DMF中有更好的分散性,使预聚体与GO之间充分接触,得到更有效的转化率。所合成的GO-MAA-MIP对DEHP的最大吸附容量为28.7 mg/g,远高于Cheng等[19]在甲醇-乙腈混合溶剂中所合成的GO-MIP的饱和容量(1.0 mg/g)。

在GO-MAA-MIP形成过程中,不同的合成条件会影响材料的构成,使分子印迹材料的吸附能力有所不同。因此,对模板分子与功能单体的比例、交联剂的比例、溶剂用量等因素进行了优化。

2.1.1模板分子与功能单体的比例

功能单体与模板分子达到一定比例才能以氢键和分子间力等形成有效的相互结合的作用力,将模板分子缔合于功能单体周围,但是,当MAA过多时,功能单体会趋于自聚合而形成较多的非特异性结合位点,会导致印迹因子下降。分别合成了n(DEHP)∶n(MAA)为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8的4种GO-MAA-MIP。各材料的吸附效果如图1所示,n(DEHP)∶n(MAA)为1∶6时,GO-MAA-MIP的吸附量最大。

图1 n(DEHP)与n(MAA)不同比例下合成的材料对DEHP的吸附效果Fig.1 Effects of adsorption for DEHP on various materials prepared with different ratios of n(DEHP)and n(MAA) DEHP:di(2-ethylhexyl)phthalate;MAA:methacrylic acid;Q:adsorption capacity.

图2 不同交联剂含量对合成的材料吸附DEHP效果的影响Fig.2 Effects of adsorption for DEHP on various materials prepared with different crosslinking contents GO:graphene oxide;MAA:methacrylic acid;MIP:molecularly imprinted polymer;NIP:non-molecularly imprinted polymer;EDMA:ethylene dimethacrylate.

2.1.2交联剂质量分数

分别以交联剂EDMA占预聚体的75%(质量分数,下同)、80%、85%和90%合成GO-MAA-MIP和GO-MAA-NIP,其对DEHP的吸附效果见图2。由图2可知,当EDMA占比为80%时,吸附量最大。当交联剂用量过少时,聚合物的交联度较低,聚合物中有效印迹空穴太少,吸附量较小;而当交联剂用量多时,预聚体中功能单体占比小,所结合模板分子相应减少;另外,当交联剂的量过多时,会在聚合物内形成较密的三维网状结构,将模板分子和功能单体形成的复合物紧紧地包裹在其中,会给模板分子的洗脱增加难度,甚至无法完全洗脱,导致吸附量减小。所以,选用EDMA占预聚体80%的比例进行合成试验。

2.1.3溶剂的用量

溶剂用量不同影响聚合反应的散热效果,预聚体各组分在体系中浓度不同也影响聚合物的相对分子质量,使最终材料的构造不同,直接影响材料的吸附性能。分别在100、120和140 mL的DMF溶剂中合成GO-MAA-MIP和GO-MAA-NIP。产品的吸附效果见图3,当溶剂DMF体积为120 mL时,吸附容量最大。在合成过程中发现,当溶剂的用量低于100 mL时,产物呈凝胶状,材料在使用中重现性差。

图3 不同溶剂量中合成的材料对DEHP的吸附效果Fig.3 Effects of adsorption for DEHP on various materials prepared with different solvent volumes

综上,合成GO-MAA-MIP的优化条件为:GO含量为1 g/L,DEHP与MAA的物质的量比为1∶6,交联剂EDMA的质量分数为80%,DMF溶剂的体积为120 mL,于70 ℃反应24 h。

图4 MAA-MIP、GO-MAA-MIP和GO的红外光谱图Fig.4 Infrared spectra of MAA-MIP, GO-MAA-MIP,and GO

2.2 GO-MAA-MIP的表征

2.2.1红外光谱表征

MAA-MIP、GO-MAA-MIP和GO 3种材料的红外光谱图如图4所示,图4中GO-MAA-MIP谱线的2 996、2 884、1 455、1 384 cm-1处为甲基吸收峰,1 731 cm-1处为羰基吸收峰,1 263和1 155 cm-1处为羧基和酯键的碳-氧键吸收峰,这几种吸收峰来自MAA和EDMA中的相关基团;1 629 cm-1处为碳-碳双键、1 049 cm-1处为醇或醚键的碳氧键的吸收峰,两者来自GO中的相关基团的吸收。所以,聚合物GO-MAA-MIP中兼有聚MAA和GO成份,说明两种材料成功共聚。

图5 (a和b)GO和(c和d)GO-MAA-MIP的TEM图像Fig.5 Transmission electron microscopy (TEM)images of (a and b)GO and (c and d)GO-MAA-MIP

2.2.2电镜图

图5是GO和GO-MAA-MIP的TEM图。如图5a和5b所示,GO为表面光滑的薄片层结构,图5c和5d显示GO-MAA-MIP的GO片层上沉积有聚合物。因此,GO-MAA-MIP是以GO片层结构为载体在其表层形成MIP层,这样的聚合物薄层结构一方面可以拥有大的比表面积,增大吸附容量,另一方面也使分子印迹位点处于表层,有助于提高吸附或洗脱过程的传质速率。

2.3 GO-MAA-MIP吸附性能的考察

2.3.1静态吸附试验

图6 GO-MAA-MIP、GO-MAA-NIP和MAA-MIP对DEHP的吸附等温线Fig.6 Adsorption isotherm of DEHP with GO-MAA-MIP,GO-MAA-NIP,and MAA-MIP

对质量浓度范围为5～60 mg/L的DEHP溶液分别进行吸附试验,结果如图6所示,随着溶液中DEHP质量浓度的增加,吸附量随之增加,质量浓度大于40 mg/L后增长缓慢,增至50 mg/L后,材料对DEHP的吸附趋于饱和,此时吸附容量为28.7 mg/g。在整个吸附过程中,GO-MAA-MIP的吸附量明显大于非印迹材料GO-MAA-NIP,表明GO-MAA-MIP对DEHP有更高的吸附能力。因为在GO-MAA-MIP制备过程中,MAA与DEHP之间以氢键、静电引力等作用力将模板分子结合于功能单体周围,聚合反应结束后,将模板分子洗脱,在聚合物层中形成了与模板分子DEHP相匹配的空穴结构,因此GO-MAA-MIP除了具有与GO-MAA-NIP相同的非特异性吸附外,还存在对模板分子的印迹吸附位点。试验还对比了颗粒状的材料MAA-MIP的等温吸附情况(见图6),其吸附容量低于GO-MAA-MIP。因为GO-MAA-MIP是以薄片层结构的GO为载体,在其表层上生成印迹聚合物层,具有纳米材料GO大比表面积的特点,同时,印迹位点处于浅表层,目标分子易于接近,能被较充分利用,所以这些优势使其吸附容量有很大提高。而MAA-MIP为颗粒状,相对来说,其比表面积较小,另一方面埋在颗粒深处的印迹空穴位点也不能被充分利用。

用Langmuir(公式(2))与Freundlich(公式(3))两种模型分析静态吸附数据。

Q=KLQmCe/(1+KLCe)

(2)

Q=KFCe1/n

(3)

其中Q为聚合物的吸附量(mg/g);KL为Langmuir吸附分配系数(L/mg);Qm为聚合物的最大吸附量(mg/g);Ce为吸附后溶液的质量浓度(mg/L);KF和n均为Freundlich参数。如表1所示,Langmuir比Freundlich方程有更好的相关系数(R2),GO-MAA-MIP材料对DEHP的吸附行为更符合Langmuir模型,表明聚合物对DEHP的吸附是单分子层吸附,聚合物表面结构较均匀。

表1 Langmuir与Freundlich方程的等温吸附参数Table 1 Adsorption isotherm constants for Langmuir and Freundlich equations

KLis the Langmuir constant related to the adsorption distribution;Qmis the maximum adsorption capacity of the adsorbent;KFis the adsorption equilibrium constant for the Freundlich equations;nis the Freundlich constant;R2is the correlation coefficient.

图7 GO-MAA-MIP、MAA-MIP和GO-MAA-NIP对DEHP的吸附速率曲线Fig.7 Curves for adsorption rates of GO-MAA-MIP,MAA-MIP,and GO-MAA-NIP for DEHP

表2 准一级和准二级速率方程的动力学参数Table 2 Kinetic constants for pseudo-first-order rate and pseudo-second-order rate equations

K1is the adsorption rate constant for the pseudo-first-order rate equations;Qeis the adsorption capacity at adsorption equilibrium;K2is the adsorption rate constant for the pseudo-second-order rate equations;R2is the correlation coefficient.

2.3.2吸附动力学试验

如图7所示,经过不同时间的萃取,GO-MAA-MIP对DEHP的吸附量在60 min内快速增加,在120 min后达到吸附平衡。相对于颗粒状的印迹材料MAA-MIP需要4 h趋于平衡(见图7),GO-MAA-MIP吸附速率较快,是由于吸附位点位于材料的表层,传质快,提高了效率。同时从图7中也可以看出,在任何时间段,GO-MAA-MIP的吸附量均明显高于非印迹材料GO-MAA-NIP,也说明了GO-MAA-MIP除了非选择性吸附外,还存在对模板分子的特异性吸附。

将吸附动力学数据用准一级动力学方程(公式(4))和准二级动力学方程(公式(5))进行分析[22,23]。

Qt=Qe-Qee-k1t

(4)

(5)

其中Qt为t时刻的吸附量(mg/g);Qe为平衡吸附量(mg/g);e为数学常数,为自然对数函数的底数;t为吸附时间(min);k1为准一级动力学方程吸附速率常数(1/min);k2为准二级动力学方程吸附速率常数(g/(mg·min))。结果见表2,准二级动力学方程的相关系数(R2)优于准一级动力学方程,材料对DEHP的吸附动力学更符合准二级动力学方程,表明GO-MAA-MIP吸附识别过程主要为化学吸附。

图8 GO-MAA-MIP和GO-MAA-NIP对DEP、DBP、DAP和DEHP的吸附选择性Fig.8 Adsorption selectivities of GO-MAA-MIP and GO-MAA-NIP for DEP,DBP,DAP,and DEHP DEP:diethyl phthalate;DBP:dibuty phthalate;DAP:diamyl phthalate.

2.3.3吸附选择性试验

DEHP、DEP、DBP和DAP作为结构类似物共同存在于溶液中,考察了GO-MAA-MIP对这4种组分的吸附选择性,如图8所示,GO-MAA-MIP对DEHP的吸附量较高,而对DEP、DBP和DAP的吸附量较小,表明印迹材料对DEHP具有较高的选择性。非印迹材料GO-MAA-NIP对4种化合物吸附量相近,只存在非特异性吸附。实验结果表明,GO-MAA-MIP聚合物层中存在DEHP的印迹位点。通过公式(6)计算印迹因子β。

β=QGO-MAA-MIP/QGO-MAA-NIP

(6)

结果见表3,DEHP的印迹因子为2.79。

表3 GO-MAA-MIP对DEHP的印迹因子Table 3 Imprinting factor of GO-MAA-MIP for DEHP

QGO-MAA-MIPandQGO-MAA-NIPare the adsorption capacities of GO-MAA-MIP and GO-MAA-NIP,respectively;βis the imprinting factor.

2.4 重复利用

同一批次合成的GO-MAA-MIP材料经过甲醇-乙酸(9∶1,v/v)溶液洗脱、乙醇洗涤,烘干后再使用。结果显示,连续5次重复使用后吸附容量没有明显下降,吸附容量保持90%以上。说明材料至少可重复使用6次。

图9 不同条件下的DEHP的回收率Fig.9 Recoveries of spiked DEHP under different conditions a.volume of elution solvent;b.elution time;c.pH value of sample solution;d.mass concentration of NaCl in sample solution.

2.5 样品萃取条件的优化

对洗脱剂用量、洗脱时间、样品溶液pH值和离子强度对回收率的影响作了考察。

分别用不同体积(0.5、1、2、3和4 mL)的甲醇-乙酸(9∶1,v/v)溶液洗脱萃取DEHP后的GO-MAA-MIP,回收率如图9a所示,用多于2 mL洗脱液时,回收率大于82%。

考察了20～120 min的洗脱时间对DEHP的洗脱效果,结果如图9b所示,经过长于40 min洗脱后,回收率大于84%。所以,选择2 mL洗脱剂,洗脱时间为45 min。

在不同的酸度条件下,GO-MAA-MIP对DEHP的萃取回收率如图9c所示,样品溶液在pH7附近回收率较高。可能原因是,在pH较低的酸性溶液中,DEHP分子中氧原子质子化,抑制了与吸附剂中的羧基形成氢键,而pH较高的环境下,吸附剂中羧基处于电离态,也不利于与DEHP的氧原子形成氢键。本试验样品在中性状态提取,所以不需要调节pH值。

样品溶液中加入不同质量浓度的NaCl(0.1～0.7 g/L),GO-MAA-MIP对DEHP的萃取回收率如图9d所示,在所考察的NaCl含量范围内,DEHP的回收率大于83%。因此,本试验样品溶液不需调节离子浓度。

2.6 方法评价

在牛奶袋空白样品中添加不同质量浓度的DEHP溶液,经过1.2.5节方法处理后经HPLC检测,以吸收峰面积(Y)为纵坐标,标准溶液的质量浓度(X,mg/L)为横坐标,绘制标准曲线。在0.5～50 mg/L范围内,相关系数(R2)为0.997 9。分别以3倍和10倍信噪比(S/N)确定检出限(LOD)和定量限(LOQ),分别为0.03和0.1 mg/L。

分别在牛奶袋空白样品中添加3种浓度的DEHP,经过提取和MIP-SPE,用HPLC检测。每个浓度做6个平行试验,考察方法的准确度和精密度,回收率列于表4。回收率为81.6%～92.4%、RSDs为3.83%～6.95%。

表4 样品中DEHP的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 4 Spiked recoveries and RSDs of DEHP in the sample solution (n=6)

图10 牛奶袋提取液的HPLC色谱图Fig.10 HPLC chromatograms of the extracting solution of the milk bag a.before MIP-SPE;b.after MIP-SPE;c.spiked with 0.5 mg/L DEHP and treated with MIP-SPE.

2.7 实际样品分析

牛奶包装袋的提取液经过GO-MAA-MIP萃取前、后,以及加标并萃取后的HPLC色谱图如图10所示。经过GO-MAA-MIP萃取后,DEHP的色谱峰明显增强,检测到牛奶包装袋提取液中DEHP含量为1.3 μg/g。如图10c所示,在样品中添加DEHP后,其吸收峰相应增加。表明采用此印迹聚合物可对样品溶液中DEHP进行有效萃取,联用HPLC可以实现检测。

3 结论

本文采用沉淀聚合法,在DMF溶剂中成功地合成了以GO为载体的表面分子印迹材料,作为分散固相萃取吸附剂,应用于样品前处理过程中塑化剂邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)的萃取,具有较高的选择性和吸附容量。以片层结构的碳纳米材料GO为载体基质,使模板分子的印迹位点均匀分布在GO表面的高聚物薄层中,比传统颗粒状的材料具有更大的比表面积,并提高了传质速率,可以克服传统MIP传质速度慢、识别位点不能充分利用以及材料形貌不均匀等不足。为测定样品中DEHP提供了一种前处理的新选择。