邓国雄 韦金儒 陈梅香

[摘要] 目的 探討艾塞那肽对蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠动脉粥样硬化血清抵抗素的影响。 方法 选取高脂喂养的6周龄载脂ApoE-/-雄性小鼠30只，按随机数字表法将其分模型组（n = 15）与艾塞那肽组（n = 15），艾塞那肽组给予艾塞那肽1.0 nmol/（kg·d），腹膜下注射，2次/d。选取高脂喂养的同龄、同遗传的背景野生型C57BL/6J雄性小鼠作对照组（n = 15）。12周后处死并收集血清，并采用自动生化分析仪测定检测总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、三酰甘油；采用酶联免疫吸附法测定抵抗素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素6（IL-6）的含量；主动脉根部作病理切片、苏木精-伊红（HE）染色并测量校正的斑块面积。 结果 模型组的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及三酰甘油水平显著高于对照组（P < 0.01）；艾塞那肽组的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及三酰甘油与模型组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。模型组的抵抗素、TNF-α及IL-6水平与对照组比较，显著升高（P < 0.01），艾塞那肽组的抵抗素、TNF-α和IL-6含量与模型组比较，显著降低（P < 0.01）；艾塞那肽组的主动脉粥样硬化校正斑块面积明显小于模型组（P < 0.05）。 结论 艾塞那肽可有效降低动脉粥样硬化小鼠的血清抵抗素水平，从而抑制炎性反应及动脉粥样硬化斑块进展，这可能是胰高血糖素样肽-1受体激动剂抗动脉粥样硬化的机制之一。

[关键词] 艾塞那肽；动脉粥样硬化；抵抗素；胰高血糖素样肽-1

[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）05（a）-0004-05

Effect of Exenatide on serum resistin in ApoE-/- mice with atherosclerosis

DEND Guoxiong WEI Jinru CHEN Meixiang

Department of Cardiovascular Medicine， the First People′s Hospital of Nanning， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530022， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Exenatide on serum resistin in atherosclerosis of apolipoprotein E knockout （ApoE-/-） mice. Methods Thirty six-week-old ApoE-/- male mice fed with high fat were randomly divided into model group （n = 15） and exenatide group （n = 15）. The exenatide group was given Exenatide 1.0 nmol/（kg·d）， subperitoneal injection twice a day. Male C57BL/6J mice fed with high fat were selected as control group （n = 15）. After 12 weeks， the serum was collected and the levels of total cholesterol， high density lipoprotein cholesterol， low density lipoprotein cholesterol and triglyceride were measured by automatic biochemical analyzer. The contents of resistin， tumor necrosis factor-alpha （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. The aortic root was pathologically sliced and stained with hematoxylin-eosin （HE）， and the corrected patch area was measured. Results The levels of total cholesterol， low density lipoprotein cholesterol， high density lipoprotein cholesterol and triglyceride in the model group were significantly higher than those in the control group（P < 0.01）. There was no significant difference in total cholesterol， low density lipoprotein cholesterol， high density lipoprotein cholesterol and triglyceride between the exenatide group and the model group （P > 0.05）； the levels of resistin， TNF-α and IL-6 in the model group were significantly higher than those in the control group （P < 0.01）， while the contents of resistin， TNF-α and IL-6 in the exenatide group were significantly lower than those in the model group （P < 0.01）. The area of corrected atherosclerosis plaque in the exenatide group was significantly smaller than that in the model group （P < 0.05）. Conclusion Exenatide can effectively reduce the level of serum resistin in atherosclerotic mice， thereby inhibiting inflammatory response and atherosclerotic plaque progression， which may be one of the mechanisms of glucagon-like peptide-1 receptor agonists in anti-atherosclerosis.

[Key words] Exenatide； Atherosclerosis； Resistin；Glucagon-like peptide-1

抵抗素是啮齿类动物脂肪细胞分泌的一种细胞因子，因其具有抗胰岛素的效应，最初被认为是肥胖与胰岛素抵抗之间的主要关联物质，故被命名抵抗素[1]。早期研究[2-4]表明，抵抗素主要影响与胰岛素作用相关的葡萄糖稳态，影响脂肪生成；随着研究进展，发现其参与炎性反应，可导致内皮功能失调、平滑肌细胞功能障碍、血管增生及血栓形成，加速动脉粥样硬化进程，增加心血管疾病风险[1，5-7]。有研究[8-9]表明，2型糖尿病患者中血清抵抗素水平与微血管病变发生及心血管病变危险分层成正相关，这提示抵抗素在糖尿病的动脉粥样硬化发病中起着重要作用。艾塞那肽是治疗2型糖尿病的一种新药，起初主要用于控制血糖，随后有研究[10]发现其还可通过多种途径减轻高糖和高脂诱导的血管内皮功能失调。然而，目前国内外有关艾塞那肽是否通过降低血清抵抗素含量影响动脉粥样硬化进程的研究未见报道。本研究应用艾塞那肽对载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠动脉粥样硬化中血清抵抗素含量的影响，探讨艾塞那肽抗动脉粥样硬化的非降糖作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

6周龄的雄性C57BL/6J野生型小鼠15只，体重（17.22±0.79）g、6周龄的ApoE-/-敲除雄性小鼠（C57BL/6J背景）30只，体重（20.12±0.96）g，均购自北京维通利华实验动物公司（动物合格证号ApoE-/-：11400700037273，C57BL/6J：114007000372）。动物饲养于该中心SPF级动物实验室，实验室空气洁净级别7级，温度（23±2）℃，湿度40%～70%，照明15 lx，明暗交替时间为12/12 h，所有小鼠均自由进食和饮水。实验过程中，研究人员均人道地对待实验动物，并严格遵守各项实验动物伦理条例。本研究经广西医科大学实验动物中心动物实验伦理委员会批准。

艾塞那肽购自美国Sigma公司（批号：012M4751V）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α，批号：x30013313）和白细胞介素6（IL-6，批号：x30013325）、抵抗素（批号：X30013219）等酶联免疫吸附剂测定（ELISA）试剂盒购于武汉华美生物工程公司。

1.2 动物模型的建立与分组

高脂饲料（1.25%胆固醇，余为普通饲料）喂养的6周龄雄性ApoE-/-小鼠30只，按随机数字表法将其分为模型组（n = 15）与艾塞那肽组（n = 15）。模型组给予高脂饮食，艾塞那肽组模型组基础上加用艾塞那肽1.0 nmol/（kg·d），腹膜下注射，2次/d。以15只6周龄的野生型C57BL/6J雄性小鼠作对照组，其饮食同模型组。连续喂养8周后，随机抽取模型组ApoE-/-小鼠2只，1%戊巴比妥钠80 mg/kg腹腔注射麻醉，充分麻醉后处死，分离并取出主动脉，先后常规脱水、再石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色，其后显微镜下观察动脉粥样硬化程度。以镜下观察到血管内膜见明显脂质条纹隆起为动物造模成功。

1.3 血脂水平测定

各组继续喂养至12周末，均禁食、禁饮过夜，次日予1%戊巴比妥钠（80 mg/kg）腹腔注射充分麻醉，行摘除眼球取血法，采血量为2 mL/只。血液标本静置2 h，3500 r/min（离心半径8.4 cm）高速离心6 min，取上层血清，用自动化生化分析仪测定血脂，包括总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、三酰甘油（TG），其中TC和TG使用酶比色法检测，LDL-C和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）采用直接测定法。

1.4 血清抵抗素、TNF-α、IL-6水平测定

采用ELISA中的夹心法检测血清抵抗素、TNF-α、IL-6水平。具体方法：①把标准品工作液先后加入前两列孔中，各浓度工作液并列加两孔，100 μL/孔。②各样品分别标记、编号，空白孔中加入100 μL样品。③37℃反应30 min。④洗板5次，每次静置 10～20 s。⑤加入酶标试剂，37℃反应30 min。⑥再洗板5次，每孔各加50 μL A、B显色液。⑦37℃条件下避光孵育10 min。⑧每孔各加终止液50 μL。⑨15 min内用酶标仪于450 nm波长处测定光密度（OD）值。⑩分别以标准品浓度为横坐标，以OD为纵坐标，绘制标准曲线。根据各样品OD值坐标上确定样本对应的浓度值。

1.5 主动脉组织病理观察及AS面积检测

以明美数码相机显微镜Mshot MC50观察HE染色病理切片，以OLYMPUS图像处理及分析软件对各组小鼠主动脉切片的动脉粥样硬化斑块面积进行分析。动脉组织标本经石蜡包埋，每张切片取3～5 μm厚度，连续切30张，每隔5張取1张行HE染色，各组取平均值作统计分析，分别检测各组斑块面积（PA）、血管管腔面积（LA），最后计算校正的斑块面积（PA/LA），结果用百分比（%）表示。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，若方差齐，两组间比较采用LSD-t检验，若方差不齐，则采用Dunnett′s T3检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血清中的血脂水平比较

与对照组比较，模型组中TC、LDL-C、HDL-L、TG水平均较对照组显著升高（均P < 0.01）；与模型组比较，艾塞那肽组的TC、LDL-C水平降低，HDL-L、TG水平升高，但差异均无统计学意义（均P > 0.05）。见表1。

2.2 各组小鼠主动脉粥樣硬化病变形态学比较

对照组：动脉管腔内膜光整，管壁各层结构清晰，动脉内膜未见明显动脉粥样斑块。模型组：动脉管腔内膜杂乱，内膜和中模边界欠清晰，可见明显动脉粥样斑块，有大量泡沫细胞和胆固醇结晶。艾塞那肽组：动脉管腔内可见少量粥样斑块， 脂质核心较小，可见有少许泡沫细胞，与模型组比较，其病变程度较轻。见图1（封四）。

2.3 各组小鼠主动脉粥样硬化病变PA/LA比较

艾塞那肽组的PA/LA明显低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.4 各组小鼠血清中TNF-α、IL-6、抵抗素水平比较

与对照组比较，模型组中血清抵抗素、TNF-α、IL-6水平明显升高（均P < 0.01）。与模型组比较，艾塞那肽组血清抵抗素、TNF-α、IL-6水平均明显降低（均P < 0.01）。见表3。

3 讨论

近年来，慢性炎性反应参与动脉粥样硬化的发病机制逐渐得到国内外学者的认同。大量研究[11-14]证实炎症细胞和炎症信号通路的激活促进粥样斑块的形成和进展，加重斑块不稳定性。最新公布的CANTOS大规模临床研究[15]表明，冠心病患者在降脂治疗的基础上给予抗炎性反应药物IL-1β单克隆抗体Canakinumab治疗，比单用降脂治疗组能显著降低心肌梗死患者的心血管风险，为进一步证实动脉粥样硬化的慢性炎症假说提供了直接证据。慢性炎性反应涉及细胞主要有血管内皮细胞、单核/巨噬细胞以及平滑肌细胞等；涉及黏附分子主要有血管细胞黏附分子-1、细胞间黏附分子-1和单核细胞趋化蛋白-1；涉及细胞因子有TNF-α、IL-6和IL-12等[16]。迄今为止，国内外多项研究[2， 8，17-19]已发现抵抗素与动脉粥样硬化患者发病进程密切相关，且抵抗素水平与血浆中炎性因子水平呈正相关，抵抗素能促进TNF-α、IL-6、IL-12等炎性因子以及血管细胞黏附分子-1、细胞间黏附分子-1和单核细胞趋化蛋白-1等黏附分子的表达。Burnett等[19]研究显示小鼠动脉粥样硬化模型和动脉粥样硬化患者中血浆抵抗素水平较对照组明显升高，且两者的动脉粥样硬化斑块中均有抵抗素表达，小鼠动物模型的动脉粥样硬化进程中，其大动脉内皮的抵抗素mRNA表达水平也明显增加。Jamaluddin等[20]研究发现抵抗素可促进人内皮细胞和血管平滑肌细胞的增殖和迁移，增加内皮细胞通透性，促进内皮细胞/单核细胞黏附和浸润。Chen等[21]研究表明，抵抗素能增加人冠状动脉内皮细胞的氧化应激反应，降低内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达，减少一氧化氮（NO）的生成，诱导动脉内皮细胞损伤。

艾塞那肽属于胰高血糖素样肽-1受体激动剂类药（GLP-1 RAs），是目前国内外临床上主要应用于治疗2型糖尿病的一类新型药物。该药具有控制血糖、改善胰岛功能、促进胰岛素增殖、降低体重、抑制细胞凋亡等作用[22]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组小鼠经高脂喂养12周后血清抵抗素及其下游炎性因子TNF-α、IL-6含量明显增高，动脉粥样硬化斑块面积形成明显；而艾塞那肽组小鼠的血清抵抗素及其下游炎性因子TNF-α和IL-6含量较模型组显著降低，动脉粥样硬化斑块校正面积与模型组比较显著减小，提示血清抵抗素在动脉粥样硬化发病及进展中起着重要作用，艾塞那肽可能通过降低血清抵抗素水平，影响血管内皮炎性反应病理过程。

基于高糖环境和脂代谢紊乱等因素，糖尿病患者均有炎性反应的病理基础，炎性反应将影响糖尿病心血管并发症的发生、发展及预后[23]。糖尿病患者心血管并发症发生早，发生率高，且其致残率、致死率较高。有研究[24-25]显示，糖尿病患者TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子较健康者明显升高，提示这些炎性因子是糖尿病心血管疾病的重要风险因子。因此，对糖尿病患者早期积极进行抗炎干预，可降低其心血管并发症的风险。本研究结果显示，艾塞那肽组与模型组比较，能降低致动脉粥样硬化的主要血脂指标TC和LDL-C，但差异无统计学意义（P > 0.05），提示艾塞那肽的抗动脉粥样硬化作用并非通过降低TC和LDL-C水平。艾塞那肽组血清抵抗素及其下游因子TNF-α和IL-6等炎症指标含量较模型组显著降低，提示艾塞那肽应用于2型糖尿病患者具有降糖兼抗炎作用，将可能有助于降低患者的心血管疾病风险。

综上所述，艾塞那肽干预能有效降低血清抵抗素水平，抑制炎性反应，延缓动脉粥样硬化进展，这可能是GLP-1 RAs有别于既往报道的抗动脉粥样硬化作用机制，其具体机制有待进一步研究。

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（收稿日期：2019-01-29 本文編辑：王 蕾）