闫丽红 杨利军 杨 涛*

（1 山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，山西 太原030001；2 山西医科大学药理学教研室，山西 太原030001）

结直肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤，近年来在我国大城市发病率和病死率逐年攀升。在结肠癌患者发生远处转移的患者中，5年存活率只有10%[1]，其在常发肿瘤中排名第3。因此，对结肠癌发生发展与发病机制的深入研究具有重要意义。剪接因子SRSF7（也称9G8）是一个可以穿梭于细胞核和细胞质之间的SR蛋白家族成员[2]，有研究报道核质穿梭的SRSF7蛋白可通过与介导mRNA出核的NXF1/TAP（mRNA核蛋白输出因子/异常糖链糖蛋白）蛋白相互作用，从而调控mRNA出核[3]，调节SRSF7蛋白的转录，促进肿瘤细胞的增殖。有研究报道SRSF7的敲低可以抑制HCT116增殖而促进凋亡[4]。目前有关SRSF7在动物水平的研究尚不明确，因此，本研究将进一步在动物水平探究SRSF7在结直肠癌生长过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料：本实验中使用的细胞株HCT116由中国科学院上海细胞库提供。BABL/c雄性裸鼠，鼠龄4~5周，体质量18~20 g，共计10只，购自北京维通利华有限公司，饲养于山西医科大学实验动物中心，为SPF级环境。本实验用McCoy's 5A培养基购自Sangon公司，胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA消化液和青链霉素混合物购自Solarbio公司。Ki-67单克隆抗体和cleaved Caspase-3多克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔/小鼠IgG/HRP聚合物PV-6000购自中杉金桥生物公司，PCR相关试剂均购自TaKaRa公司，SRSF7 shRNA病毒由吉凯基因公司合成。

1.2 实验方法

1.21 慢病毒载体的构建：设计srsf7 shRNA干扰靶点序列（5'-AGGAG AGUUAGAAAGGGCU-3'）并在两端添加限制性核酸内切酶酶切位点以完成载体构建。将合成的单链DNA oligo（干粉）溶解于退火缓冲液中（终浓度20 μm），90 ℃水浴15 min。冷却至室温后，形成带有黏性末端的双链。然后插入由XmaⅠ/SmaⅠ酶切的慢病毒GV110载体（购自上海吉凯基因生物公司），并进行转化和鉴定。

1.2.2 细胞培养、病毒感染及筛选稳定敲减细胞株：结直肠癌细胞系HCT116在37 ℃、5%CO2且湿度饱和条件下，使用含10%的胎牛血清和1%的青链霉素的McCoy's 5A培养基进行培养。

根据病毒感染说明书，细胞密度达到30%~40%时吸去培养基，换为新培养基，量为原培养基的一半，加入Polybrene（50 μg/mL）和用ENI.S稀释SRSF7-shRNA和control-shRNA病毒，8～12 h后更换新鲜培养基。72～96 h荧光显微镜下观察观察GFP表达效率。加入嘌呤霉素进行筛选，每24 h更换含嘌呤霉素的培养基，2 d传代1次，0.25%胰酶消化传代，传代3~4次后收集细胞。

1.2.3 裸鼠的饲养与细胞接种

1.2.3.1 裸鼠的饲养：随机分组，每组5只，SPF无菌环境中饲养，恒温、恒湿、清洁、无特殊病原体，每3 d定期更换垫料，清洁饮用水、饲料供裸鼠自由摄入。

1.2.3.2 细胞接种：取处于对数期细胞用胰酶消化，经离心后收集细胞，用无血清的McCoy's 5A培养基重悬，细胞计数，控制每毫升细胞数1×107/mL。使用刻度为1 mL的注射器抽取处理好的细胞悬液0.2 mL，待皮下注射使用。

实验组和对照组分别注射稳定敲低SRSF7和转染空载体的HCT116细胞。观察待成瘤后每天测量瘤体的长径和短径，肿瘤体积计算方式：体积V（mm3）＝长径（L）×短径（W）2/2。

1.2.4 瘤体分离：待肿瘤长到1~1.5 cm3时，采取脱颈处死裸鼠。用实验手术器械对肿瘤进行肿瘤取材。将肿瘤浸入生理盐水中，将做石蜡切片的部分取材后浸入4%多聚甲醛，其余部分做RNA提取，然后分别打开胸腔、腹腔继续观察。

1.2.5 组织RNA提取和Real-time PCR：将肿瘤组织放在预冷的研钵，加入适量液氮。用Trizol法提取肿瘤内的RNA，经逆转录成cDNA，然后进行Real-timePCR反应，反应条件为条件为94 ℃预变性30 s循环1次，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s循环40次。本实验中所使用引物序列如下：上游引物序列：ATGCTTATGATTGTCATCGTTACAGC，下游引物序列：GGAGATGCTGACCTTGACCTTC。

1.2.6 标本制作及免疫组化染色：将肿瘤组织置于4%多聚甲醛中固定过夜，然后进行石蜡包埋、切片。石蜡切片经过常规烤片、烘片处理后进行抗原修复，50 mL/L的牛血清白蛋白（BSA）封闭20~25 min后加入一抗37 ℃孵育1 h。PBS冲洗2 min×3次后，二抗孵育37 ℃ 20 min，然后使用DAB显色剂显色。苏木素染色，封片。使用Image-J软件对不同切片的染色强度进行检测，然后进行统计学分析。

1.2.7 HE染色：切片制作完成后，入Coverstainer全自动HE染色封片机进行染色，依次经过烤片、二甲苯3 min×2次、100%乙醇1 min×2次、70%乙醇1 min、流水冲洗1 min、苏木精1 min 30 s、流水冲洗1 min、蒸馏水1 min、蓝化液1 min、流水冲洗1 min、95%乙醇1 min、伊红2 min、100%乙醇1 min×3次、二甲苯2 min×3次，封片后结束HE染色程序。

1.2.8 统计学分析：本实验结果均采用SPSS17.0和GraphPad Prism6.02统计学软件处理，进行统计分析。两组间的差异统计采用t检验；P<0.05认为具有统计学显著性差异。

图1 敲减SRSF7基因后，裸鼠移植瘤生长曲线

图2 移植瘤SRSF7 RNA的表达水平的检测

图3 HE染色和免疫组化Ki-67、cleaved Caspase-3在实验组和对照组中的表达（×40）

2 结 果

2.1 SRSF7shRNA慢病毒感染结直肠癌细胞HCT116及筛选：我们成功构建了SRSF7shRNA慢病毒，感染HCT116细胞后，筛选稳定敲低SRSF7细胞株，其中shCtrl是对照组，sh-SRSF7是实验组。选出生长状态良好及稳定表达绿色荧光的细胞。

2.2 SRSF7移植瘤动物模型的建立：裸鼠在接种1周后肉眼便可见皮下有一约0.1 cm3大小的肿块结节。每天观察，分别记录成瘤时间和瘤体的体积。绘制移植瘤的生长曲线，由图1可见，实验组裸鼠的瘤体体积及生长速度较对照组明显减慢，有显著差异（P＜0.05）。

2.3 SRSF7mRNA表达水平的鉴定：采用Real-time PCR实验分析移植瘤中SRSF7 mRNA的表达情况，由图2结果显示SRSF7在实验组的表达水平低于对照组，差别有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 移植瘤免疫组化染色的检测：结直肠癌肿瘤动物模型建立后，分别取移植瘤进行HE染色和Ki-67、cleaved Caspase-3的免疫组化染色。由图3结果显示，肿瘤细胞异型性明显，核大深染，核分裂像多见，排列为不规则的细胞结构；统计分析实验组的Ki-67表达阳性率较对照组减少66%；同时观察到实验组的cleaved Caspase-3表达阳性率较对照组增加37%，差别有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

肿瘤动物水平的研究相比较肿瘤细胞水平更能模拟人体内环境的生长情况。因此，在细胞水平的基础上进一步进行动物水平的研究是肿瘤研究和治疗的重要一步。

肿瘤的动物模型包括自发肿瘤模型、诱发肿瘤模型、同种移植肿瘤模型、异种移植肿瘤模型等[6]，其中异种移植模型是目前最常用于研究恶性肿瘤的方法，其常用的荷瘤动物是免疫缺陷动物[7]。由于裸鼠具有免疫缺陷的特点，在实验条件下，一般不排斥来自异种动物的细胞或组织移植，因此可以作为移植人类恶性肿瘤的接受体[8]。目前，常用于建立结直肠癌移植瘤动物模型的方法包括细胞移植和组织移植，根据其接种部位的不同，又可以分为皮下移植和原位移植[9]。其中，通过将结直肠癌细胞接种于免疫缺陷动物皮下所建立的皮下移植瘤模型，是目前肿瘤研究中应用最早和最为广泛的，具有操作简单、成瘤率较高，便于观察肿瘤的发生、生长情况等优点[10]。

Pre-mRNA选择性剪接是基因转录后表达调控的一个重要机制，通过选择性剪接可以产生不同的mRNA异构体，从而翻译出不同的蛋白质[11]。剪接因子SRSFs可通过结合在pre-mRNA上的增强子上，或是竞争RNA结合位点而影响选择性剪接[12]。有研究报道，SRSF7作为一种在肿瘤中高表达的原癌基因，通过细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂P21的表达水平来影响细胞的增殖[13]。

Ki-67是应用最广泛的增殖细胞标记之一[14]，检测Ki-67是评估人类各种组织增殖分化的简单而可靠的方法。Cleaved Caspase-3是检测细胞凋亡的标志之一，是细胞凋亡早期阶段激活的关键蛋白酶，在细胞凋亡过程中起中心环节作用[15]，可以评估人类各种组织的凋亡情况。本实验选取这两种常用的指标进行免疫组化染色检测，结果显示实验组Ki-67蛋白表达较对照组明显增加，而cleaved Caspase-3表达较对照组减少。说明实验组的肿瘤细胞生长与增殖活性小于对照组，而凋亡增加，从而证实敲减SRSF7基因对肿瘤的生长与增殖具有抑制作用。

研究发现SRSF7敲低可以抑制HCT116细胞的增殖和的凋亡，在此基础上，我们通过构建SRSF7慢病毒颗粒，感染并筛选稳定敲低SRSF7的HCT116，通过皮下注射BABL/c小鼠，成功建立结直肠癌皮下移植瘤模型，通过观察及测量，发现实验组移植瘤体积及生长速度较对照组减慢；通过Real-time PCR检测移植瘤中SRSF7的表达情况，发现实验组的表达较对照组明显降低，综合以上研究结果，进一步在动物水平验证了敲减SRSF7具有抑制肿瘤生长的作用。