丁 赫，郭乐薇，徐高青，王 军，吕文发

（吉林农业大学动物科技学院，吉林省反刍动物繁育生物技术与健康养殖工程实验室，吉林长春130118）

生物钟通过外部信号和内部时间系统之间的协调，调控着机体的代谢、激素水平、体温、睡眠等生化和生理过程。生物钟是一种基于转录翻译的反馈回路，使基因和蛋白以24 h 为周期循环表达，并且当外界昼夜交替的现象消失时，这样的节律一直存在[1-3]。在生物钟系统中，BMAL1 和CLOCK 是核心的生物钟基因，它们通过与目的基因启动子的特异元件E-boxes 结合，调控基因的转录[4-5]。昼夜节律机制被破坏影响着机体的生理状况，可能导致肥胖、衰老、哮喘、癌症、神经系统紊乱等多种疾病[6-9]。哺乳动物的睾丸主要包括支持细胞和间质细胞2 种细胞，具有产生精子和雄激素的重要作用。有研究表明，在小鼠睾丸间质细胞中存在BMAL1 蛋白的表达，并且呈现明显的昼夜节律规律[10]，但BMAL1 对小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响仍不清楚。本实验利用qRT-PCR、Western Blot 和流式细胞技术研究敲减BMAL1 对小鼠睾丸间质细胞凋亡水平及凋亡相关蛋白（BAX 和BCL-2）表达的影响，明确BMAL1对小鼠睾丸间质细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 BMAL1 siRNA 细胞转染 根据说明书操作，将离心管3 000 r/min 离心1 min，取125 μL DEPC 水加入到离心管中，配制成20 μmol/L 溶液。将小鼠睾丸间质细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司，CL-0234）传代至6 孔板中，1×105个/孔，37℃ 5% CO2培养箱中培养细胞24 h，待细胞完全贴壁，细胞生长到80%～90%时开始转染。10 μL LipofectamineTM2000 加入到250 μL 普通培养液中，轻轻混匀，室温孵育5 min；9 μL BMAL1 siRNA 和BMAL1 siRNA NC（Negative Control），siRNA 序列见表1，分别加入到250 μL 的普通培养液中，轻轻混匀，室温孵育5 min。……