熊璐琪，赵博欣

(1.广东省惠州市中心人民医院药学部，惠州 516001；2.南方医科大学南方医院药学部，广州 510515)

作为一种影响核酸合成的细胞毒类药物，氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)至今仍广泛应用于头颈部肿瘤、消化道肿瘤、乳腺癌、肺癌等的治疗。其主要不良反应包括腹泻、黏膜炎、口腔炎、恶心、呕吐以及骨髓抑制等。从药物代谢角度考虑，多种药物代谢酶在5-FU的代谢解毒和代谢活化中起重要作用[1]，因此其药动学存在明显的个体差异。然而，有文献报道，其血药浓度与不良反应之间有很强相关性[2-3]。一项随机Ⅲ期临床试验显示，依据药动学指标调整5-FU剂量，明显提高疗效并降低不良反应发生率，随访结果显示患者总生存获益[4]。

卡培他滨作为一种5-FU前体药物，经胃肠道给药后，在体内活化为5-FU从而发挥抗肿瘤的作用[5]。由于肿瘤组织中胸腺嘧啶脱氧核苷酸磷酸化酶显著多于正常组织，使得该药有一定的靶向性。鉴于卡培他滨在体内代谢过程中的复杂性，加之其与5-FU具有相类似的最终代谢过程，卡培他滨同样表现出较大的个体差异。然而，笔者尚未见依据卡培他滨药动学参数来个体化调整给药剂量从而改善患者临床收益的相关系统性研究。

为了获得临床患者卡培他滨的药动学参数，高效快速的定量方法是其重要的关键技术。国外虽有采用液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法测定卡培他滨及其代谢产物报道，国内却鲜有相关研究。不仅如此，现有报道的方法由于存在样本预处理过于繁冗，检测时间过长，定量限过高，重复性差等不足，难以在临床实践中开展。因此，笔者采用亲水性液相色谱-串联质谱(hydrophilic liquid chromatography series mass spectra，HILIC-LC-MS/MS)方法快速定量卡培他滨及其活性代谢产物，旨在为临床提供更加高效、快速、简洁的定量方法，以便为临床针对此类药物相关的个体化精准治疗提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent1260 液相色谱-G6460三重四级杆质谱联用仪(G1312B型四元输液泵，G367E型自动进样器，G1316A型柱温箱，G1322A型脱气机)色谱工作站：(B.04.01 SP2)，P13110S 电子天平(德国Sartotins公司，感量：0.1 mg)；Centrifuge 5810R高速离心机(美国Eppendorf公司)。

1.2试药 卡培他滨对照品(批号：ZZS17010904)、5-FU对照品(批号：ZZS17010908)均购于上海甄准生物科技有限公司；乙腈、甲酸、乙酸铵为色谱纯，其他化学试剂均为化学纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为Agilent Poroshell 120 Hilic (2.1 mm×50 mm，2.7 μm)； 流动相为乙腈- 25 mmol·L-1乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)(95：5)；流速：0.3 mL·min-1； 柱温30 ℃。

2.2质谱条件 离子源为电喷雾离子源(ESI源)；Vcap 毛细管电压4 000 V；干燥器温度340 ℃；离子源雾化器(N2)，流量：9 L·min-1； 雾化气压力241.325 kPa。卡培他滨和5-FU的碰撞能分别为-13 eV和-17 eV；裂解电压均为7 V。

2.3工作液及质量控制样品的制备 精密称取卡培他滨及5-FU适量，并溶解于乙腈中，分别制成浓度为400及750 μg·mL-1的储备液。将储备液用乙腈连续稀释制成含两种成分浓度为390.625，781.25，1562.5，3125，6250，12 500，25 000，50 000及100 000 ng·mL-1的混合工作液。用储备液以同样方法单独稀释成浓度为781.25，6250，50 000 ng·mL-1的高、中、低浓度质量控制样品。所有溶液均保存于4 ℃环境中，使用前室温放置复温。

2.4血浆样品的处理 取血浆样品100 μL加入乙腈400 μL作为提取溶剂，涡旋混合1 min，低温20 000×g离心15 min，转移上清液，取2 μL用于 液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)分析。

2.5质谱分析 应用ESI负离子模式进行检测。卡培他滨在全扫描的模式下，母离子为358.1(M-H)具有很高的液质响应值，其他杂质不干扰母离子的测定。进行子离子扫描时，当裂解电压为130 V，碰撞能为13 eV时，卡培他滨主要离子碎片为m/z=154.1。5-FU在全扫描的模式下，母离子的碎片为m/z=129(M-H)，在多离子反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式下，子离子的碎片为m/z=42.1，碰撞能为17 eV，裂解电压为90 V时，响应值最稳定，卡滨他滨及5-FU的质谱图见图1，MRM图见图2。

2.6方法专属性 分别取6份不同来源不含相关检测药物的人空白血浆，按“血浆样品处理”项下操作，进行LC-MS/MS检测。结果表明，空白血浆中内源性物质不干扰待测物卡培他滨及5-FU的测定。并且在样品的检测时无杂峰干扰。见图3。

A.卡培他滨；B.5-FU

Fig.1Productionspectraofcapecitabineand5-fluorouracil

A.空白样品；B.卡培他滨；C.5-FU

Fig.2MRMchromatogramofcapecitabineand5-fluorouracil

2.7标准曲线的绘制 取工作液10 μL，真空干燥后，加入空白血浆100 μL涡旋混匀，配制成最终浓度为39.062 5～10 000 ng·mL-1的含药血浆，加入乙腈400 μL，以待测物浓度为横坐标，待测物的峰面积值为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归，卡培他滨的回归方程为：Y=5.0645X+60.783，R2=0.999 3 (n=9)，5-FU的回归方程：Y=2.651 3X+37.845，R2=0.999 2 (n=9)，方法线性范围在39.062 5～10 000 ng·mL-1。

A.TIC；B.卡培他滨；C.5-FU

由于本方法主要适用于临床检测，尽管LC-MS/MS法检测灵敏度高，但由于临床检测中卡培他滨及5-FU至31.25 ng·mL-1以下的意义有限，因此，本法中卡培他滨及5-FU的最低定量限均为31.25 ng·mL-1(S/N>10)。

2.8提取回收率 取空白血浆100 μL，按“2.7”项下方法制备低(78.125 ng·mL-1)、中(625 ng·mL-1)、高(5000 ng·mL-1)浓度的质量控制样品各6份，进样2 μL，记录卡培他滨及5-FU峰面积A1；同时检测(低、中、高)3种质量控制浓度对应检测药物标准溶液，进样2 μL，所得峰面积A2。血浆中提取回收率(%)=A1/A2×100%：卡培他滨低、中、高浓度提取回收率分别为(78.22±3.15)%，(75.37±2.99)%及(81.05±2.78)%，5-FU低、中、高浓度的提取回收率分别为(70.45±2.19)%，(72.56±1.68)%及(72.02±1.72)%。上述结果表明，卡培他滨及5-FU的提取前后一致性良好并且没有浓度依赖性，提取回收率较高，适用于该方法检测。

2.9精密度和准确度实验 取空白血浆100 μL，按“2.7”项方法配制低、中、高浓度的卡滨他滨及5-FU的质量控制样本，测定日内精密度以及连续测定3 d，并与标准曲线同时进行，计算质量控制样品的测得浓度，与配制浓度对照，求得本法准确度与精密度。计算得准确度满足定量分析中90%～110%的范围，日内以及日间精密度均在±15%(表1)。

2.10稳定性实验 按“2.7”项下方法配制低、中、高3个浓度含药血浆，室温条件下放置1和24 h后，处理样本，与新鲜配制的储备液比较；样本处理后，1 h与24 h后进样分析，与新鲜配制的储备液比较；分别于-20 ℃反复冻融3次和样品预处理后室温放置24 h，使用相同处理条件，比较放置后所检测浓度是否稳定。RE(%)=(测量浓度-理论浓度)/理论浓度×100%。考察样品的稳定性，结果见表2，在上述考察条件下，3个浓度无显著变化，RE均<10%，上述数据证明卡培他滨及5-FU在室温、样品处理、反复冻融的条件下均稳定，实验结果准确可靠。

2.11基质效应 取6种不同来源空白血浆，分为6组，每组各制备3个空白血浆样品，按照血浆样品提取方法进行空白样品提取。离心后，于每组3管溶液中分别加入低(781.25 ng·mL-1)、中(6250 ng·mL-1)或高(50 000 ng·mL-1)浓度卡培他滨及5-FU标准溶液各10 μL，旋涡10 s，20 000×g离心15 min后取上清液进样。以此种处理方法测定的卡培他滨与5-FU峰面积与以水为替代基质处理的相应浓度样品峰面积的比值计算百分比，结果表明，低、中、高浓度的卡培他滨和5-FU的基质效应影响百分比平均值分别为125.45%，131.10%，130.95%及118.34%，126.63%，124.08%，表明两药在低、中、高浓度下基质效应对血药浓度测定影响程度基本一致。

2.12血浆卡培他滨及5-FU浓度检测的临床应用 20例患者以卡培他滨说明书规定剂量口服药物1～2周，随机抽取服药前全血并分离血浆，对卡培他滨及5-FU的稳态谷浓度进行检测。患者卡培他滨的平均血药浓度为2802.424 ng·mL-1，分布区间为1 661.627～4 438.821 ng·mL-1；5-FU的平均血药浓度为343.365 ng·mL-1，分布区间为133.735～674.165 ng·mL-1。以卡培他滨血药浓度为横坐标，相对应患者5-FU的血药浓度为纵坐标进行线性回归分析(图4)，R2=0.1996，表明两药间相关性较差。因此，同时检测卡培他滨与5-FU的血药浓度具有较好的临床意义。

表1 3种质量控制浓度的日内及日间精密度

浓度/(ng·mL-1)卡培他滨日间第1天第2天第3天日内5-FU日间第1天第2天第3天日内78.12574.378±2.23074.013±2.37076.156±3.24074.849±1.14775.374±1.96078.573±2.31079.354±3.03077.767±2.109625617.394±11.480624.782±9.620627.573±9.670623.250±5.260624.421±13.240621.853±12.740628.844±13.970625.039±3.53650004936.234±45.2304899.118±51.9204968.352±49.5204934.568±34.6474897.823±39.7505012.834±45.8204978.752±42.9404963.136±59.074

表2 卡培他滨及5-FU在人血浆中的稳定性

药品与浓度新鲜配制室温放置1 h测定RE/%室温放置24 h测定RE/%反复冻融1 h测定RE/%反复冻融24 h测定RE/%卡培他滨 低浓度74.842±1.97476.183±2.0451.79275.748±2.8741.21174.893±1.9390.06874.084±2.62-1.015 中浓度618.428±11.736620.312±14.1590.305618.074±11.620-0.057621.858±12.5180.555623.717±13.2900.855 高浓度5001.980±58.2104987.295±46.749-0.2944975.390±46.765-0.5325005.237±45.3740.0655041.741±52.5660.7955-FU 低浓度77.916±1.84176.018±1.991-2.4476.386±1.746-1.96474.532±2.369-4.34377.090±2.062-1.060 中浓度625.931±12.375623.641±14.159-0.366624.856±11.6e0-0.172618.243±11.354-1.228617.322±12.929-1.375 高浓度5012.364±46.2534997.452±52.443-0.2984985.563±46.737-0.5355011.756±47.560-0.0124997.432±52.467-0.298

图4 临床患者卡培他滨与其活性代谢产物5-FU血药浓度相关性

Fig.4Correlationofplasmaconcentrationofcapecitabineand5-fluorouracilinclinicalpatients

3 讨论

卡培他滨是一种新型口服氟嘧啶核苷类似物，在体内转变为5-FU发挥抗肿瘤作用，由于其不良反应相对5-FU较轻，近年来逐渐在临床中替代5-FU使用。从生物药剂学的角度，卡培他滨在口服给药后约1.5 h内达到血药峰浓度，稍后5-FU达到峰浓度。进入循环后，卡培他滨可广泛分布于全身各组织当中，其中，在消化道、肝脏、肾脏组织中的药物浓度较高，在脑组织内药物浓度较低。卡培他滨主要在肝脏中代谢并经肾脏排泄，尿中排泄率为80%～90%，其药物原型的排泄率仅为3%[6]。由于卡培他滨转化为其活性代谢产物需要经过较多次的酶促反应，且其代谢酶均存在影响其活性的SNP位点，因此，同时检测卡培他滨及其活性代谢产物5-FU的血药浓度对评价卡培他滨的治疗效果及预测其毒副作用具有重要的临床意义。

目前，国内常用高效液相色谱法对卡培他滨或5-FU进行检测[7-8]。但由于色谱法专属性差、操作步骤繁琐、检测时间长，不仅增加检验难度，还降低该项目检测临床开展的适用性。而另一种主流治疗药物监测的化学法，采用抗原抗体反应，可检测5-FU的血药浓度，但尚无卡培他滨的相关试剂盒上市。而化学法的药物浓度检测，操作步骤亦较多，试剂盒成本较高，且抗原抗体反应易受到内源性物质或相关药物代谢产物的干扰，从而影响检测的准确度。而国外虽已采用LC-MS/MS法测定卡培他滨或5-FU，但分析方法存在诸多问题。如SALVADOR等[9]使用LC-MS/MS法同时测定人血浆中卡培他滨及其代谢物的浓度，所采用的洗脱方法对色谱柱伤害大，色谱运行时间长，且采用固相萃取法处理样品，操作繁琐，成本高，耗费大。HERMES等[10]使用LC-MS/MS法同时测定人血浆中5-FU及卡培他滨的浓度，其使用衍生化法处理样品，虽色谱运行时间短但样本处理过程操作繁琐复杂，降低分析效率的同时还增加了成本。MONTANGE等[11]报道LC-MS/MS法同时测定人血浆中卡培他滨及其代谢物的浓度，色谱运行时间长达15 min，且样品需重复测定，样本需要量大(一次需使用500 μL)，分析效率低，不利于临床的应用及推广。TSUME等[12]采用LC-MS/MS法同时测定生物样品中5-FU及其代谢物的浓度，所采用的方法得到5-FU的定量下限为25 ng·mL-1，灵敏度低。

本研究建立一种快速同时检测人血浆中卡培他滨及其活性代谢产物5-FU的LC-MS/MS的检测方法，具有以下优点：①专属性强，采用LC-MS/MS方法在固有设备特点中相较其他检测设备具有更高的检测专属性，不易受到极性类似或结构类似内源性成分或代谢产物的影响。②灵敏度高，采用本方法对两种成分进行检测，达到在线性范围内小于40 ng·mL-1的检测限，并在低浓度区间内表现出较好的精密度与准确度。③样品需求少，本方法检测中仅需血浆样品100 μL进行同管检测，且检测速度快，仅2 min即可完成1例样品中卡培他滨及5-FU的同时检测。④检测方法学稳定，精密度、稳定性及回收率等均较为稳定，表明该方法适用于临床血浆样品检测。⑤样本处理过程简单。

应用建立的方法对临床患者血浆样品进行检测，结果表明，患者血浆中卡培他滨及5-FU的分布区间均较宽泛，表明卡培他滨的血药浓度存在个体差异性，进而其活性代谢产物的浓度存在较大差异。卡培他滨与其对应样品中代谢产物5-FU血药浓度的相关性较差，证实卡培他滨与其活性产物间在代谢过程中可能存在代谢酶活性的个体差异。由于5-FU的血药浓度对卡培他滨的临床疗效及不良反应均有较好的指导意义。因此，笔者建立同时检测卡培他滨及5-FU血药浓度的方法，一方面可以通过5-FU的血药浓度评价并推测服用卡培他滨进行化疗患者的临床收益，对于浓度未在合理区间的患者及时调整剂量，另一方面同时对卡培他滨进行检测，可以在调整剂量过程中更确切得知不同代谢酶活性患者在卡培他滨向5-FU代谢为程中的实际生物转化情况，从而有利于实现更好的临床疗效并减少不良反应。

卡培他滨与5-FU的保留时间分别为0.610和0.611 min，若在传统的HPLC条件下进行紫外检测，两色谱峰将无法分离，但通过MRM检测模式具有色谱与质谱分离的能力，根据各自独特的分子结构所产生的母离子和碎片离子，以质谱的高分辨能力，同时检测不同的物质，最终形成图谱，通过色谱工作站(B.04.01 SP2软件)将卡培他滨及5-FU各自的色谱图提取出来，两药的含量测定结果互不干扰。

综上所述，采用LC-MS/MS法以乙腈提取血浆样品来同时检测卡培他滨与5-FU的浓度，是一种具有高灵敏度、高专属性、简单快捷且稳定的检测方法。此法能快速检测生物样品中卡培他滨及5-FU，适用于卡培他滨制剂相关临床治疗中的治疗药物监测。