夏 雯，吴 亮，阴 晴，戴晓玥，邹治情，吴 瑶，周亚玲，何 蕾

(1. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013； 2. 江苏大学附属医院检验科，江苏 镇江 212000)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是造成医院感染的主要病原菌之一，可以导致呼吸系统、皮肤软组织、泌尿系统感染，以及心内膜炎等[1-2]。近年来,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)已成为临床常见的耐药菌株[3-4]。在全球范围内，从医院感染患者分离的SA菌株中MRSA菌株已占45%以上[5-6]。

SA主要耐药基因为mecA，同时也存在其他的耐药基因，主要包括aacA-D、tetK、tetM、msrA、msrB、ermA、ermC 、vatA、vatB、vatC、femB 和linA等。其中aac类、erm类、tet类基因分别可诱导SA对氨基糖苷类、大环内酯类和四环素类抗生素耐药[7]。SA的重要毒力因子包括杀白细胞素(panton-valentine leukocidin，PVL)、溶血毒素(hemolysin)、肠毒素(enterotoxin)、中毒休克综合征毒素I(toxic shock syndrome toxin)和表皮剥落毒素(exfoliative toxin)等。PVL是近年来被关注的毒力因子，携带pvl基因的MRSA菌株具有高侵袭性，可破坏人体的免疫系统，导致皮肤和软组织感染以及难治性坏死性肺炎等。研究[8]表明，MRSA社区感染菌株中pvl基因携带率高达50%～93%，感染该菌株的患者在无法获得及时治疗的情况下病死率极高，而MRSA医院感染菌株中pvl基因携带率较低。目前，对于医院感染SA基因携带情况研究较少。本研究对江苏大学附属医院重症监护病房(ICU)医院获得性肺炎患者痰标本中的MRSA菌株耐药基因和pvl基因携带情况进行调查，探讨该院SA的耐药机制，评估其致病力。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2018年6—12月江苏大学附属医院ICU中医院获得性肺炎MRSA感染患者的痰标本，纳入标准：医院获得性肺炎患者，且无其他部位感染，诊断符合《医院感染诊断标准》中下呼吸道感染的诊断标准。所有菌株均经VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统鉴定为MRSA。

1.2 方法

1.2.1 仪器和试剂 VITEK 2 Compact为法国生物梅里埃公司产品，2×PCR 预混液购自南京 Vazyme 公司， 蛋白酶K溶液(20 mg/mL)为美国 Merck公司产品，电泳级琼脂糖为西班牙进口分装，PCR扩增仪为杭州博日公司所生产，溶菌酶溶液(20 mg/mL)为美国Amersco公司产品，DNA Marker购自大连宝生物公司。

1.2.2 DNA的提取 参考文献[9]报道的改良碱裂解法提取SA DNA，具体方法如下：取过夜培养新鲜SA菌液1 mL以12 000 rpm离心2 min，弃上清，于沉淀中加入200 μL溶液Ⅰ和20 μL溶菌酶溶液充分吹打，使沉淀完全重悬，置37℃温箱中过夜裂解。次日加入20 μL 蛋白酶K溶液，于55℃水浴30 min后加入现配的300 μL溶液Ⅱ,上下颠倒10次并静置5 min。加入冰上预冷的溶液Ⅲ，上下颠倒5次后冰上放置5 min，以12 000 rpm离心5 min后取上清600 μL，加入等体积的酚∶氯仿∶异丙醇(25∶24∶1)，剧烈震荡后置4℃高速离心机以12 000 rpm离心10 min，取上清500 μL并加入400 μL异丙醇，于-20℃中放置4 h沉淀DNA，沉淀使用70%乙醇洗涤2次放置空气中干燥后，重新溶解于50 μL灭菌蒸馏水中，备用。

1.2.3 耐药基因的检测 应用聚合酶链反应(PCR)法检测SA携带的耐药基因。PCR反应体积共25 μL，包括2×PCR预混液12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，最终以灭菌蒸馏水补足体积至25 μL。循环条件：94℃变性5 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 60 s，35个循环，72℃ 延伸10 min。引物序列和退火温度见表1[10]。取5 μL扩增产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果，并照相记录[11]。

1.2.4 SCCmec类型的检测 参考文献[12]中SA SCCmec基因分型的方法，引物序列见表2。PCR反应体积共25 μL，包括2×PCR预混液12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，以灭菌蒸馏水补足体积至25 μL。循环条件：94℃变性5 min，94℃ 45 s、65℃ 45 s、72℃ 90 s，10个循环，再94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 90 s，20个循环，72℃ 延伸10 min。PCR反应结束后，采用1.2%琼脂糖电泳检测结果，并照相记录。

表1SA耐药基因寡核苷酸引物序列及PCR扩增条件

Table1Oligonucleotide primer sequences and PCR amplification conditions ofStaphylococcusaureusresis-tance gene

基因 引物序列(5’-3’)退火温度(℃)产物大小(bp)mecAF:AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC 55532R:AGTTCTGCAGTACCGGATTTGCaacA-DF:TAATCCAAGAGCAATAAGGGC55227R:GCCACACTATCATAACCACTAermAF:AAGCGGTAAACCCCTCTGA55190R:TTCGCAAATCCCTTCTCAACermCF:AATCGTCAATTCCTGCATGT55299R:TAATCGTGGAATACGGGTTTGtetKF:GTAGCGACAATAGGTAATAGT55360R:GTAGTGACAATAAACCTCCTAtetMF:AGTGGAGCGATTACAGAA55158R:CATATGTCCTGGCGTGTCTAvatAF:TGGTCCCGGAACAACATTTAT55268R:TCCACCGACAATAGAATAGGGvatBF:GCTGCGAATTCAGTTGTTACA55136R:CTGACCAATCCCACCATTTTAvatCF:AAGGCCCCAATCCAGAAGAA55467R:TCAACGTTCTTTGTCACAACCmsrAF:GGCACAATAAGAGTGTTTAAAGG55940R:AAGTTATATCATGAATAGATTGTC CTGTTlinAF:GGTGGCTGGGGGGTAGATGTATTA ACT-GG55323R:GCTTCTTTTGAAATACATGGTATTT TTC-GA

1.2.5pvl基因的检测 采用PCR检测方法。根据文献[13]合成SApvl基因检测引物，引物序列为F:5’-ATGGTCAAAAAAAGACTATT-3’ R: 5’-TCAATTATGTCCTTTCACTTTAATTTC-3’，PCR扩增产物大小为939 bp。PCR反应总体积为25 μL，其中2×PCR预混液12.5 μL，上、下游引物0.5 μL，DNA模板2 μL，以灭菌蒸馏水补足体积至25 μL。94℃变性5 min，94℃ 60 s、51℃ 60 s、72℃ 60 s，36个循环，72℃ 延伸10 min。PCR反应结束后，取5 μL扩增产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果，并照相记录。

表2SA SCCmec基因分型检测引物序列及扩增产物大小

Table2Primer sequences and amplification product size of SCCmec genotyping ofStaphylococcusaureus

基因引物序列(5’-3’)产物大小(bp)SCCmecIF:GCTTTAAAGAGTGTCGTTACAGG613R:GTTCTCTCATAGTATGACGTCCSCCmecⅡF:CGTTGAAGATGATGAAGCG398R:CGAAATCAATGGTTAATGGACCSCCmecⅢF:CCATATTGTGTACGATGCG280R:CCTTAGTTGTCGTAACAGATCGSCCmecIVaF:GCCTTATTCGAAGAAACCG776R:CTACTCTTCTGAAAAGCGTCGSCCmecIVbF:TCTGGAATTACTTCAGCTGC493R:AAACAATATTGCTCTCCCTCSCCmecIVcF:ACAATATTTGTATTATCGGAGAGC200R:TTGGTATGAGGTATTGCTGGSCCmecIVdF:CTCAAAATACGGACCCCAATACA881R:TGCTCCAGTAATTGCTAAAGSCCmecVF:GAACATTGTTACTTAAATGAGCG325R:TGAAAGTTGTACCCTTGACACC

2 结果

2.1 一般资料 2018年6—12月江苏大学附属医院ICU中，共有46例医院获得性肺炎MRSA感染的患者，其中男性36例(78.26%)，女性10例(21.74%)；年龄13～87岁。从痰标本中分离出MRSA 46株。46例患者的主要疾病为重症肺炎，且均为呼吸机相关肺炎(VAP)。

表346株MRSA对7种抗菌药物的耐药情况

Table3Resistance of MRSA strains to 7 kinds of antimicrobial agents

抗菌药物耐药菌株耐药率(%)红霉素1941.30四环素1736.96环丙沙星1634.78克林霉素1634.78莫西沙星1226.09庆大霉素1123.91复方磺胺甲口恶唑1226.09

2.3 耐药基因携带情况 46株MRSA中，携带多种耐药基因。耐药基因检出率为10.87%～100%，以mecA基因检出率最高，达100%，其次为femB、aacA-D、ermC基因，检出率分别为71.74%、54.35%、52.17%。见表4、图1。

2.4 毒力因子pvl基因检测结果 46株MRSA中，30株检出pvl基因，检出率为65.22%。SApvl基因扩增产物大小为939 bp，其大小与预期结果一致。见图2。

表446株MRSA耐药基因携带情况

Table4Carrying status of resistance genes of 46 strains of MRSA

耐药基因株数检出率(%)mecA46100.00aacA-D2554.35tetK1736.96msrA613.04ermA1736.96ermC2452.17femB3371.74linA510.87

M：2 000 bp DNA分子质量标准；1～9为阳性标本；N：阴性对照

M：2 000 bp DNA分子质量标准；1～9：阳性标本；N：阴性对照

Figure2Electrophoresis map of PCR amplification pro-ducts of MRSApvlgene

2.5 SCCmec基因分型结果 46株MRSA中共检出4种SCCmec基因类型，其中SCCmecⅡ型12株(26.09%)，SCCmec Ⅲ型24株(52.17%)，SCCmec Ⅳc型1株(2.17%)，SCCmec Ⅴ型1株(2.17%)。见图3。

3 讨论

MRSA是临床常见的多重耐药菌，能引起中毒性休克、脓毒血症和重症肺炎等疾病，是医院感染监控的重点。由于抗菌药物的长期大量使用，近年来临床感染中MRSA的检出率已高达50%～70%[14]。通常认为MRSA在社区和医院感染菌株中的高分离率归结于青霉素等抗菌药物的长期大量使用，在抗菌药物的正向选择压力下，对甲氧西林敏感的SA获得mecA基因后转变为MRSA。本研究中，ICU医院获得性肺炎患者痰标本分离的MRSAmecA基因携带率达到100%。mecA基因是外源性基因，该基因可通过质粒方式水平传播并整合入SA SCCmec基因中，造成SA耐药[12]。此外，SCCmec基因区域还存在各种其他耐药基因，均可能诱导SA对其他抗菌药物产生耐药性[15]。SCCmec基因可以用于判断SA的来源，共分为Ⅰ～Ⅴ5种类型，携带Ⅱ型和Ⅲ型SCCmec基因的菌株主要来源于医院感染，其他类型主要来源于社区感染[4]。本研究中的MRSA主要为SCCmecⅡ、SCCmecⅢ型，为医院感染菌株。传统的SCCmec基因分型方法需以PCR法扩增整个SCCmec基因片段再进行测序分析，整个过程耗时费力，无法满足临床快速简便的需要。本研究中使用的PCR法可以直接检测出SCCmec基因型别，省去了传统SCCmec基因分型检测的繁琐，并且该方法操作简便、快速，适合于在临床实验室中广泛推广。SCCmec基因与MRSA的耐药基因传递以及多重耐药性密切相关，MRSA SCCmec基因型别在不同地区比例分布差异较大，且各区域携带的耐药基因也不相同，定期开展MRSA SCCmec基因分型及耐药基因检测对于判断传染源，控制医院感染的发生和蔓延具有重要意义。

M：2 000 bp DNA分子质量标准；1～6：阳性标本；N：阴性对照

图3MRSA SCCmec基因分型PCR扩增产物电泳图谱

Figure3Electrophoresis map of PCR amplification products of MRSA SCCmec genotyping

由ermA/ermC基因编码的甲基化酶是MRSA对大环内酯类抗生素耐药的主要机制[15]。本研究菌株中对大环内酯类药物耐药率为41.30%。ermA和ermC耐药基因携带率共计为36.96%，耐药基因的携带率低于细菌耐药率。推测该现象可能与ermA/ermC基因存在上游调控基因有关，但其确切机制有待进一步研究。

tetK编码产四环素外排泵蛋白基因，该外排泵蛋白可以将药物泵出细胞膜外，降低药物浓度，导致SA对四环素类抗生素耐药性。本研究中，MRSA对四环素耐药率为36.96%，与tetK耐药基因携带率完全相同，表明tetK是诱导该院MRSA获得四环素耐药性的重要原因，并且tetK也可以成为耐四环素SA的重要分子标记，可以用于此类细菌的快速筛查。

PVL是SA重要的外毒素，属于膜孔形成毒素家族，最早由Van deVelde发现，1932年由Panton和Valentine将其从溶血素中分离出来[16]。PVL可造成细胞或组织的坏死，致病性极强。研究[17]表明，社区获得性MRSA中pvl基因携带率高达77%～100%，而医院获得性MRSApvl基因携带率不超过5% 。但本研究中ICU医院获得性肺炎患者痰中MRSApvl基因携带率高达65.22%，导致如此高的确切原因有待进一步研究，医务人员对此结果也应高度重视。

综上所述，该院ICU分离的MRSA菌株携带多种耐药基因，且pvl基因携带率也较高。在临床治疗过程需高度重视高毒力SA的出现，合理使用抗菌药物，降低细菌耐药性的产生。