郑 哲，吴宣瑾，焦 钰，黄荣莲，杜晓东, 2



马氏珠母贝基因的克隆及组织表达

郑 哲1，吴宣瑾1，焦 钰1，黄荣莲1，杜晓东1, 2

（1. 广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2. 广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心，广东 湛江 524088）

【】克隆马氏珠母贝（）抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase，TRACP) 基因，分析该基因在不同组织中的表达模式。【】用RACE技术克隆得马氏珠母贝基因（），用实时荧光定量PCR分析该基因在外套膜、闭壳肌、足、性腺、珍珠囊、肝胰腺和鳃中的表达。【】基因长度为2 034 bp，开放式阅读框972 bp，编码323个氨基酸，5′UTR长度为27 bp，3′UTR长度为1 035 bp。预测PmTRACP分子质量约为36.39 ku，理论等电点为5.97。该基因含有一个钙调神经磷酸酶样磷酸酯酶结构域。PmTRACP与其他物种TRACP的同源性为48% ~ 65%，与长牡蛎（）TRACP的同源性最高，同时D32、D70、Y73、N108、H203、H212、H237、H239等8个氨基酸活性位点和N114糖基化位点在不同物种TRACP中高度保守。PmTRACP与长牡蛎TRACP的亲缘关系最近。在马氏珠母贝各个组织均有表达，且在肝胰腺和珍珠囊中高表达。

马氏珠母贝; 抗酒石酸酸性磷酸酶; 基因克隆；基因表达；实时荧光定量PCR

抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase，TRACP）是酸性磷酸酶的第5型同工酶，对酒石酸不敏感，是一种在活性部位含双核金属离子络合物的金属酶，广泛存在于动物、植物、真菌等细胞中[1]。TRACP可根据其最适pH从其他磷酸酶中分离，同时由于活性域中酪氨酸Fe3+的一个电荷转移而出现典型的紫色特征，故亦被称为紫色酸性磷酸酶（Purple acid phosphatases，PAPs）[2]。该家族成员均含5个保守结构域，其中7个划线的氨基酸残基为不变氨基酸，存在于酶活性部位的二价金属离子协调中心[3-4]。在脊椎动物中，位于破骨细胞微粒体的TRACP与其他酶一起参与骨基质固体矿化物降解，从而参与骨稳态的动态调控[5-6]，是测定骨吸收和破骨细胞活性的标志物[7-8]。

软体动物分泌的贝壳、珍珠与脊椎动物骨骼类似，均通过机体矿化组织细胞分泌的基质蛋白控制生物矿化而形成，其TRACP是否有类似脊椎动物的功能尚待研究。Zang等[9]在淡水腹足类光滑双脐螺（）成体外套膜组织中检测到TRACP表达，并将其作为区分胚胎贝壳形成组织与成体外套膜组织的细胞标志物。马氏珠母贝（）亦称合浦珠母贝（），隶属于珍珠贝属，是海水育珠重要贝种，亦是研究生物矿化的重要模型。Wang等[3]发现马氏珠母贝基因参与由脂多糖（Lipopolysaccharides, LPS）引发的非特异性免疫及植核育珠过程的免疫反应。因此，进一步研究功能，探究其与生物矿化关系可为马氏珠母贝育珠研究提供基础资料。本研究克隆并分析马氏珠母贝的TRACP基因，并用荧光定量 PCR 技术检测该基因在马氏珠母贝各组织中的表达量，为进一步研究马氏珠母贝抗酒石酸酸性磷酸酶的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

马氏珠母贝取自广东省湛江市徐闻养殖基地，为规格一致的健康2龄贝。取马氏珠母贝外套膜边缘区（Mantle edge，ME）、外套膜套膜区（Mantle pallium，MP）、中央膜区（Mantle central，MC）、足（Foot，F）、肝胰腺（Hepatopancreas，HE）、性腺（Gonad，GO）、闭壳肌（Adductor muscle，A）和鳃（Gill，GI），用液氮速冻后，于-80℃冰箱保存。DH5α感受态细胞，由广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心实验室保存。

Trizol购自Invitrogen公司，Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H)、Reconbinant Rnase Inhibitor、DNA 分子标记、pMD19-T 载体等购自TaKaRa公司；RACE 试剂盒购自Clontech公司，反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，琼脂糖H购自上海生工生物工程有限公司，SYBR®Select Master Mix购自Applied Biosystems公司。

1.2 总RNA的提取以及cDNA的合成

用 Trizol法提取马氏珠母贝各组织的总RNA，通过10 mg/mL琼脂糖凝胶电泳验证完整性，运用 Nano Drop ND1000 紫外分光光度计分析浓度及纯度。参照SMARTerTM RACE cDNA Amplification kit的说明书操作获得 5′ RACE和 3′ RACE 模板；参照Reverse Transcriptase M-MLV（RNaseH）说明书合成实时荧光定量cDNA模板。

1.3 PmTRACP基因全长序列获得

根据马氏珠母贝转录组数据库中的unigene序列设计基因特异性引物，扩增其中间片段，连接到PMD19-T载体并转化到DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，送上海生工生物工程有限公司测序，验证正确后，按照clontech的SMARTTM RACE cDNA amplification kit说明书以及参考本实验室王志新等的方法[10]进行巢式PCR扩增，得5′和 3′末端序列，通过10 mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，分离纯化的目的基因片段连接到PMD19-T载体后转化到DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆测序，将测序后的序列与已知的片段拼接获得cDNA全长，所用基因特异性引物见表1。

表1 PmTRACP基因克隆及 qRT-PCR所用引物

1.4 基因生物信息学分析

对测序结果用VecScreen（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/tools/vecscreen/）去除载体序列，并用 DNAMAN 软件拼接，获得TRACP的cDNA全长序列，并预测基因的ORF和氨基酸序列；分子质量和等电点的预测在expasy中（http://web.expasy. org/compute_pi/）进行；通过SignalP 4.1 (http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽。运用SMART（http://www.ebi.ac.uk/ interpro/）预测其结构域。运用 Cluster W（http：//www.genome.jp/tools/ clustalw/）结合NCBI在线Blastp（https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行同源性分析；用Mega 6软件构建生物系统进化树。

1.5 PmTRACP基因组织差异表达

用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测在马氏珠母贝各组织中的表达情况。以 cDNA第1链为模板，以作内参基因，反应体系（10 µL）：10 µmol/L上、下游引物各0.4 µL，cDNA 0.5 µL，SYBR® Select Master Mix 5 µL，灭菌的ddH2O 3.7 µL。反应条件：95 ℃下预变性2 min，95 ℃下变性 15 s，60 ℃下退火1 min，40循环，添加 1个溶解曲线。每个样品进行重复3次。

1.6 数据处理

利用 2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。用基因表达量作为目的基因表达量的校对基准。运用SPSS 18.0对实验数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），并用Duncan’s多重比较对均值进行差异显著性检验，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 PmTRACP基因的克隆与特征分析

用RACE技术克隆的基因cDNA全长为2 034 bp，开放阅读框972 bp，编码323个氨基酸，5′ UTR长度为27 bp，3′ UTR长度为1 035 bp。预测蛋白分子质量为36.39 ku，理论等电点为5.97，分析发现，含有一由21个氨基酸组成的信号肽序列，该基因含有一个钙调神经磷酸酶样磷酸酯酶结构域（图1）。

2.2 PmTRACP的同源性比对和系统进化分析

多序列比对分析发现，PmTRACP与其他物种TRACP的同源性较低，为47% ~ 65%，但D32、D70、Y73、N108、H203、H212、H237、H239等8个氨基酸活性位点在不同物种的TRACP中高度保守，同时N114糖基化位点在各物种间亦极为保守（图 2）。构建的PmTRACP与其他物种TRACP系统进化树（图 3）表明，PmTRACP与哺乳类和鱼类的TRACP相距较远，与双壳贝类的TRACP聚为一支，且与长牡蛎的TRACP亲缘关系最近。

经预测，发现PmTRACP与数据库中人的TRACP（SMTL ID: 1war.1）相似度最高，为40%，以其为模型获得PmTRACP的三维结构见图4。此外，对太平洋牡蛎（）的TRACP进行三维结构预测，并与之相比较，发现PmTRACP与太平洋牡蛎TRACP结构高度相似，空间结构的高度保守性暗示各物种该蛋白分子功能相似。

粗体表示翻译起始和终止密码子; 星号表示终止密码; 下划线表示推测的信号肽序列; 阴影部分表示钙调神经磷酸酶样磷酸酯酶结构域; 方框表示推测的多聚腺苷酸化信号

*标记的氨基酸为活性位点; #标记的氨基酸为N糖基化位点; 百分比值代表PmTRACP和其他物种TRACP之间的序列同一性

图3 邻接法构建的TRACP家族系统进化树

图4 马氏珠母贝(A)、太平洋长牡蛎(B)及组合后(C) TRACP蛋白分子的空间结构

2.3 PmTRACP在不同组织中的表达分布

图5可见，基因在马氏珠母贝的外套膜中央区、外套膜边缘区、闭壳肌、足、性腺、珍珠囊、肝胰腺和鳃中均有表达，但表达量存在明显差异，肝胰腺中的表达量最高，其次是珍珠囊和性腺。

MC, 外套膜中央区; ME, 外套膜边缘区; A, 闭壳肌; F, 足; GO, 性腺; PS, 珍珠囊; HE, 肝胰腺; GI, 鳃; *, P < 0.05

3 讨论

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)是酸性磷酸酶家族中的金属蛋白酶，在骨骼的形成和骨稳态的调控中发挥重要作用。本研究克隆得全长序列。分析发现，其N端含有一个由21氨基酸组成的信号肽。人类中，TRACP含有一个信号肽，成熟肽于血液中分泌并发挥重要作用[11-12]，因此PmTRACP可能亦于血液中分泌并发挥功能。另外，PmTRACP氨基酸序列在第25 ~ 240氨基酸处含有一个钙调神经磷酸酶样磷酸酯酶结构域，该结构域存在于各种磷酸酯酶中，且含有较多保守的金属螯合残基[13]。经比对，PmTRACP与其同物种TRACP的同源性为48% ~ 65%，但各物种TRACP在关键的8个氨基酸活性位点（D32、D70、Y73、N108、H203、H212、H237、H239）[14]和N114糖基化位点上高度保守，提示其催化功能的保守性。PmTRACP与长牡蛎的TRACP亲缘关系最近，且三级结构高度相似。以上结果进一步证明，PmTRACP属于TRACP家族的一员，且功能有保守性。

目前，关于的组织分布相关研究主要集中在哺乳动物中[1, 15-16]，而在低等动物，尤其是双壳贝类研究较少。本研究发现，在马氏珠母贝的外套膜中央区、外套膜边缘区、闭壳肌、足、性腺、珍珠囊、肝胰腺和鳃中均有表达，但在肝胰腺和珍珠囊中的表达量显著性高于其他组织。肝胰腺为软体动物主要的免疫器官，也是消化、吸收和代谢最旺盛的器官，在肝胰腺中的表达量最高，提示该基因可能参与马氏珠母贝的免疫反应。Wang等[3]检测马氏珠母贝TRACP家族的另一成员pm-PAP，发现基因也在肝胰腺、鳃和血细胞等免疫防御组织中表达。在脊椎动物中，PAP也参与机体的免疫反应[17]。此外，也可能该酶在该器官合成后运输到其他部位参与生命活动。在人体中，TRACP可参与骨骼形成和调控骨稳态，同时也是骨吸收和破骨细胞活性的良好标志物[18]，珍珠的形成过程与骨的形成过程均为典型的生物矿化过程[19]。而珍珠囊是珍珠形成的组织，在马氏珠母贝珍珠囊中有较高的表达量，暗示该基因可能参与珍珠形成过程。而是否通过负调控机制参与马氏珠母贝珍珠的形成尚需进一步研究。以上结果可为进一步研究马氏珠母贝抗酒石酸酸性磷酸酶的作用机制提供基础资料。

[1] HALLEEN J M, ALATALO S L, SUOMINEN H, et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption[J]. J Bone Miner Res, 2010, 15(7): 1337-1345.

[2] OHASHI T, MIURA T, IGARASHI Y, et al. Monoclonal antibody specific to tartrate-resistant acid phosphatase 5b and use thereof: USPatent 7,074,903[P]. 2006-07-11.

[3] WANG Q H, JIAO Y, DU X D, et al. Molecular characterization and expression analysis of purple acid phosphatase gene from pearl oyster[J]. Genetics and Molecular Research: GMR, 2015, 14(1): 552-562.

[4] FLANAGAN J U, CASSADY A I, SCHENK G, et al. Identification and molecular modeling of a novel, plant-like, human purple acid phosphatase[J]. Gene, 2006, 377: 12-20.

[5] Halleen J M, Räisänen S R, Alatalo S L, et al. Potential function for the ROS-generating activity of TRACP[J]. Bone Miner Res, 2010, 18(10): 1908-1911.

[6] MORI Y, KASAI H, OSE A, et al. Modeling and simulation of bone mineral density in Japanese osteoporosis patients treated with zoledronic acid using tartrate-resistant acid phosphatase 5b, a bone resorption marker[J]. Osteoporosis International, 2018, 29(5): 1155-1163.

[7] 张新菊, 李融. 骨代谢标志物相关研究进展[J]. 山东医药, 2014, 54(16): 93-95.

[8] 黄干, 伍贤平. 抗酒石酸酸性磷酸酶与骨吸收[J]. 临床与病理杂志, 1998, 18(1): 4-6.

[9] MARXEN J C, WITTEN P E, FINKE D, et al. A light- and electron-microscopic study of enzymes in the embryonic shell-forming tissue of the freshwater snail,[J]. Invertebrate Biology, 2003,

122(4): 313-25.

[10] 王志新, 梁海鹰, 杜晓东, 等. 马氏珠母贝热休克蛋白基因的克隆与表达分析[J]. 广东海洋大学学报, 2013, 33(6): 14-23.

[11] 虞佳音, 汪静宇. 抗酒石酸酸性磷酸酶在恶性肿瘤中的研究进展[J]. 世界华人消化杂志, 2017, 25(23): 2133-2138.

[12] REITHMEIER A, PANIZZA E, KRUMPEL M, et al. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP/ACP5) promotes metastasis-related properties via TGFβ2/TβR and CD44 in MDA-MB-231 breast cancer cells[J]. BMC Cancer, 2017, 17(1): 650.

[13] ARAVIND L, KOONIN E V. Phosphoesterase domains associated with DNA polymerases of diverse origins[J]. Nucleic Acids Res, 1998, 26(16): 3746-52.

[14] MARCHLERBAUER A, BO Y, HAN L, et al. CDD/SPARCLE: functional classification of proteins via subfamily domain architectures[J]. Nucleic Acids Res, 2017, 45(Database issue): D200-D203.

[15] HALLEEN J M, ALATALO S L, JANCKILA A J, et al. Serum tartrate-resistant acid phosphatase 5b is a specific and sensitive marker of bone resorption[J]. Clin Chem, 2001, 47(3): 597-600.

[16] CHAO T Y, YU J C, KU C H, et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b is a useful serum marker for extensive bone metastasis in breast cancer patients[J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(2): 544-550.

[17] KUMANOMIDOU T, NISHIO K, TAKAGI K, et al. The structural differences between a glycoprotein specific F-box protein Fbs1 and its homologous protein FBG3[J]. PLoS one, 2015, 10(10): e0140366.

[18] HANNON R A, CLOWES J A, EAGLETON A C, et al. Clinical performance of immunoreactive tartrate-resi- stant acid phosphatase isoform 5b as a marker of bone resorption[J]. Bone, 2004, 34(1): 187-94.

[19] WESTBROEK P, MARIN F. A marriage of bone and nacre[J]. Nature, 1998, 392(6679): 861.

Cloning and Tissue Expression Analysis ofGene in

ZHENG Zhe1, WU Xuan-jin1, JIAO Yu1, HUANG Rong-lian1, DU Xiao-dong1,2

(1.,,524088,; 2.,524088,)

【】 To clone the full length of tartrate resistant acid phosphatase (TRACP) gene in the pearl oysterand analyze the expression profile ofat different tissues. 【】Thegene in pearl oyster(designated as) was obtained by RACE, and quantitative real-time PCR was used to detecte the expression level ofin different tissues including the mantle, adduct muscle, foot, gonad, pearl sac, hepatopancreas and gill.【】The length ofis 2 034 bp, with an open reading frame of 972 bp that encodes 323 amino acids, 5′ untranslated region (UTR) was 27 bp, and 3′ UTR is 1 035 bp. The predicted molecular weight of PmTRACP was 36.39 ku and the theoretical isoelectric point was 5.97. PmTRACP contains a calcineurin-like phosphatase domain. Multiple sequence alignment showed that the TRACP homology betweenand other species ranged from 48% to 65%, with the highest homologyto. The 8 amino acid active sites (D32, D70, Y73, N108, H203, H212, H237, H239) and the N-glycosylation site (N114) are highly conserved in different species of TRACP. Phylogenetic analysis showed that PmTRACP was mostly close to TRACP of. Quantitative real-time PCR analysis showed thatmRNA was constitutively expressed in different tissues, with significantly high expression in the hepatopancreas and pearl sac.

; tartrate resistant acid phosphatase; quantitative real-time PCR

Q78; Q959.215+43

A

1673-9159（2019）03-0024-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.004

2018-11-02

国家自然科学基金(31672626)

郑哲（1988－）女，博士，讲师，研究方向为海洋生物学。Email：haidazhengzhe@163.com

杜晓东，男，博士，教授。Email：zjduxd@126.com

郑哲，吴宣瑾，焦钰，等. 马氏珠母贝基因的克隆及组织表达[J]. 广东海洋大学学报, 2019, 39(3): 24-29.

（责任编辑：刘庆颖）