李朋钰 李映 杨涛 田平芳 田国英 葛喜珍

摘要：采用菌丝生长速率法和共毒因子法，测定小檗碱与山豆根、炉甘石、芸薹素内酯、复硝酚钠复配剂对番茄灰霉病的抑制作用。结果表明，小檗碱（0.280 mg/mL）与10%山豆根（2.257 mg/mL）、小檗碱（0.155 5 mg/mL）与炉甘石（0.062 5 mg/mL）复配使用对灰霉病菌抑制效果较佳，小檗碱与芸薹素内酯、复硝酚钠复配能促进灰霉菌生长。电镜观察发现，经小檗碱和山豆根、炉甘石复配处理的灰霉病菌菌丝扭曲、干瘪。田间防效试验结果表明，10%小檗碱可湿性粉剂1 000倍稀释液对灰霉病菌的防效为71.7%，小檗碱与山豆根、炉甘石、复硝酚钠、芸薹素内酯合用均能增加小檗碱对番茄灰霉病的防效。由此可知，小檗碱可与山豆根、炉甘石、芸薹素内酯、复硝酚钠复配用于番茄灰霉病防治。

关键词：小檗碱;复配剂;灰霉病;抑菌活性

中图分类号：S436.412         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）01-0056-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.01.013           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Inhibition of Berberine with other Components on Botrytis cinerea

LI Peng-yu1，LI Ying1，YANG Tao1，TIAN Ping-fang2，TIAN Guo-ying3，GE Xi-zhen1

（1.College of Biochemical Engineering，Beijing Union University，Beijing 100023，China;

2.College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China;

3.Shijiazhuang Academy of Agriculture and Forestry Science，Shijiazhuang 050000，China）

Abstract： The antibacterial activity of berberine with radix Sophorae tonkinensis，calamine，brassinolide and compound sodium nitrophenolate on Botrytis cinerea was studied by the method of mycelial growth rate and co-toxicity factor. The results showed that both of complex of berberine（0.280 mg/mL） and radix Sophorae tonkinensis （2.257 mg/mL） or berberine（0.155 5 mg/mL） and calamina（0.062 5 mg/mL） had strong inhibition against B. cinerea. However， the mixtures of berberine and brassinolide or compound sodium nitrophenolate could promote the growth of B. cinerea. Scanning electron microscope analysis revealed that the mycelia of B. cinerea manifested abnormity including distortion and collapse. The results of field control experiments showed that the control effect of 10% berberine was 71.7%. Furthermore， berberine combined with radix Sophorae tonkinensis， calamina， brassinolide and compound sodium nitrophenolate could increase the control effect of berberine against Botrytis cinereal. So it could be hypothesized that complex drugs could inhibited the gray mold cell membrane and played an antibacterial effect.

Key words： berberine; mixtures; Botrytis cinerea; antibacterial activity

灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染所致的真菌性植物病害，引起番茄、黄瓜、葡萄等果蔬叶子和果实的腐烂，继而造成果蔬的腐烂枯死，严重影响这些经济作物的产量[1，2]。目前防治灰霉病以三唑类、吡咯类、嘧啶胺类、甲基硫菌灵、异菌脲等化学药剂为主[3]。化学药物不仅作用靶点单一，且药物残留对环境和人体都有巨大的危害[4，5]。近年来，寻找合适的生物源杀菌剂和生防菌、减少环境污染、确保食品安全是农药研究的重点[6，7]。小檗碱作为传统治疗肠胃炎的中药成分，广泛存在于黄连、黄柏等植物中，来源丰富，价格低廉[8]。山豆根是越南槐（Radix Sophorae tonkinensis）的干燥根茎，主要成分为生物碱、黄酮、皂苷类物质，常用于治疗咽喉肿痛、火毒蕴结[9];炉甘石是一种主要成分为碳酸锌的复杂矿物集合体，具有解毒明目退翳，收湿止痒敛疮等功效[10];芸薹素内酯是一种广谱植物生长调节剂，能提高农作物的抗病性缓解药害[11];复硝酚钠是一种集营养、调节、预防为一体的植物生长调节剂，可与其他抑菌成分复配使用从而提高药效[12]。前期研究发现，小檗碱对桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）和灰霉病菌（即灰葡萄孢菌）防效好[13，14]。然而在实际生产上不可能仅使用一种杀菌剂。本试验对小檗碱与山豆根、炉甘石、芸薹素内酯、复硝酚钠复配的相容性进行了研究，结果发现，山豆根、炉甘石、芸薹素内酯、复硝酚钠单独使用对番茄灰霉病菌有抑制作用，但最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌浓度（Minimum bactericidal concentration，MBC）均较大。通过探究小檗碱分别与山豆根、炉甘石、云薹素内酯、复硝酚钠复配对番茄灰霉病菌的抑制作用，以期为小檗碱的研究和指导生产提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

番茄灰霉病菌（ATCC 11542）由北京化工大学提供。小檗碱（简称BBR，97%）购自陕西慧科生物发展有限公司，山豆根（10%）、炉甘石购自长安中药材有限公司，0.1%芸薹素内酯、0.2%复硝酚钠购自河南神雨生物科技有限公司，10%小檗碱可湿性粉剂（自制）。

PDA培养基：新鲜去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，加去离子水定容至1 000 mL，分装10瓶待用。

1.2  方法

1.2.1  小檗碱及其他成分对灰霉病的毒力测定  采用菌丝生长速率法[15]测定小檗碱及其他成分分别对番茄灰霉病菌的毒力。将小檗碱与其他成分母液稀释为一系列浓度，按照表1比例分别加入经115 ℃灭菌25 min后冷却至55 ℃左右的PDA培养基中，制成系列浓度含成分PDA平板，以加无菌水为空白对照。用直径为8 mm的打孔器取在28 ℃恒温培养箱避光培养3 d的灰霉病菌菌饼，接种于含不同成分不同浓度梯度的PDA平板上。将各平板倒置于28 ℃恒温培养箱内，避光培养，24 h后，每隔12 h用十字交叉法测量并记录菌落直径。根据番茄灰霉病菌在不同药物梯度平板上的生长速率，计算出小檗碱及其他成分对番茄灰霉病的半最大效应浓度（EC50）、不同浓度成分对灰霉病的生长抑制率。其中，菌落直径=测量菌落直径平均值-8;抑制率=（空白组菌落直径-加药处理组菌落直径）/空白组菌落直径×100%。

1.2.2  小檗碱与其他成分最小抑菌浓度和最小杀菌浓度  设置分别含小檗碱（0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mg/mL）、10%山豆根（25、50、75、100、125、150 mg/mL）、炉甘石（1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25 mg/mL）、芸薹素内酯（25、50、75、100、125、150 mg/mL）、复硝酚钠（25、50、75、100、125、150 mg/mL）的培养基抑制番茄灰霉病菌，将菌饼接种至培养基28 ℃培养，12 h后观察培养基上番茄灰霉病菌菌丝生长情况，无菌丝生长，则该浓度即为MIC值，72 h后未见菌丝生长的浓度即为MBC值。

1.2.3  小檗碱与其他成分复配  根据等效线法[16]，以小檗碱和山豆根为例，按照各自EC50的浓度配制母液，复配比例按照表2分别制备含小檗碱和山豆根的PDA培养基，将8 mm的番茄灰霉病菌菌饼接种到培养基表面中央，28 ℃培养，24 h后采用十字交叉法测量菌落直径。采用共毒系数法计算共毒因子，若共毒因子大于20，则表示两药之间有协同作用;若共毒因子小于-20，则表示两药之间有拮抗作用;若共毒因子为-20～20，则表示两药之间作用相加。其中，混剂理论抑制率=小檗碱理论抑制率+其他成分理论抑制率;共毒因子=[（混剂实际抑制率-混剂理论抑制率）/混剂理论抑制率]×100%。

1.2.4  不同成分处理灰霉病菌电镜观察  采用“1.2.2”的方法，设置小檗碱和山豆根、炉甘石复配空白对照和EC50对照组，用玻片覆盖法采集菌丝，将均匀长着灰霉病菌丝的盖玻片，用1%戊二醛溶液固定12 h，然后用0.15%戊二醛冲洗;用10%、30%、50%、70%、90%乙醇溶液梯度洗脱5 min，100%乙醇溶液洗脱10 min，充分脱水;真空冷冻干燥;将样品固定到样品台，喷金，扫描电镜观察。

1.2.5  小檗碱与不同成分复配对灰霉病的田间防效试验  田间试验设在北京市密云番茄种植基地日光室，品种为原味。试验时间为2016年3月10日至5月12日。田间防治用清水处理作为对照;每个浓度4次重复，共20个小区，随机排列，每小区500株。施药时间为3月18日、3月29日、4月10日、4月25日，共计施药4次。最后一次施药10 d后调查灰霉病病果率，计算防效。番茄灰霉病的分级标准及药效计算方法按照《农药田间药效试验准则》进行[17]，记录病果个数。病果分级采用如下标准：0级，无病斑;2级，残留花瓣发病或柱头发病;3级，萼片腐烂或柱头发病蔓延到果脐部;5级，果脐部有浸润斑但无霉层;7级，果脐部有霉层但未扩展到其他部位。

药效计算方法：病果率=（病果数/调查果数）×100%，防治效果=[（对照病情指数-处理区病情指数）/对照区病情指数]×100%）。

1.2.6  数据处理  各试验操作重复3次。用SPSS进行数据处理，所给出的数据均是平均值±标准差;OriginPro9.1 绘图。

2  结果与分析

2.1  小檗碱与其他成分对灰霉病的EC50、MIC及MBC

由表3可知，小檗碱抑制番茄灰霉病菌的EC50为0.311 mg/mL，MIC为3.25 mg/mL，MBC为6.50 mg/mL;10%山豆根对番茄灰霉病菌的EC50为22.570 mg/mL，MIC为150.00 mg/mL，MBC为275.00 mg/mL;炉甘石对番茄灰霉病菌的EC50为0.908 mg/mL，MIC为9.25 mg/mL，MBC为18.75 mg/mL;芸薹素内酯对番茄灰霉病菌的EC50为6.292 mg/mL，MIC为50.00 mg/mL，MBC为125.00 mg/mL;复硝酚钠对番茄灰霉病菌的EC50为2.113 mg/mL，MIC為25.00 mg/mL，MBC为100.00 mg/mL。除小檗碱外，其他成分的MIC值与MBC值均偏大，故考虑与其他成分复配使用。

2.2  小檗碱与其他成分复配对番茄灰霉病的抑制效果

由图1、图2可知，小檗碱与炉甘石复配对番茄灰霉病菌有很强的抑制作用，通过空白组（对照）与试验组对比发现，0.155 5 mg/mL小檗碱+0.062 5 mg/mL炉甘石在菌落生长的各个阶段抑菌效果最好，抑菌率超过50%，但试验中发现，炉甘石的溶解性差，其溶解于培养基的具体浓度并未检测出。与对照相比，小檗碱与10%山豆根复配对番茄灰霉病菌生长有一定抑制作用;小檗碱与芸薹素内酯复配对番茄灰霉病菌生长有促进作用;小檗碱与复硝酚钠复配也有促进番茄灰霉病菌生长的现象。

2.3  小檗碱与山豆根复配对灰霉病的药效评价

根据“2.2”試验结果，选择了复配成分对灰霉病菌抑制效果较好的小檗碱和山豆根，并对其药效进行了评价。从表4可以看出，小檗碱与10%山豆根按9a/10+b/10复配时，共毒因子大于20，表明在该复配比下有协同增效作用;按8a/10+2b/10、2a/10+8b/10和a/10+9b/10复配时，共毒因子为20～-20，说明在该复配比下小檗碱和10%山豆根之间有相加作用;其他配比情况下，共毒因子小于-20，表示复配的小檗碱和10%山豆根之间有拮抗作用。因此，小檗碱与10%山豆根的最佳复配为9a/10+b/10，即0.280 mg/mL小檗碱+2.257 mg/mL 10%山豆根。

2.4  小檗碱与其他成分复配对灰霉病菌菌丝形态的影响

由图3可知，与处理组相比，正常生长的菌丝平滑、丰满、粗细均匀。小檗碱与山豆根、炉甘石处理后，菌丝多出现缠绕扭曲，菌丝表面出现断裂、干瘪、褶皱、塌陷等粗细不均的形态，菌丝萎缩脱水严重，部分菌丝甚至出现溶解断裂。基于这些成分处理后菌丝呈现异常的形态变化，表明小蘖碱与山豆根、炉甘石复配对番茄灰霉病有强烈的抑制作用。

2.5  小檗碱与不同成分复配对灰霉病的田间防效

由表5可知，对照的病果率为31.6%。10%小檗碱可湿性粉剂1 000倍稀释液单独使用防效71.7%，小檗碱与山豆根、炉甘石、复硝酚钠、芸薹素内酯合用均能增加小檗碱对番茄灰霉病的防效。在实验室培养番茄灰霉病的情况下复硝酚钠、芸薹素内酯均能不同程度促进病原菌生长。

3  小结与讨论

本试验研究了山豆根、炉甘石、复硝酚钠及芸薹素内酯分别与小檗碱复配对灰霉病菌的抑菌效果。结果表明，小檗碱与山豆根、炉甘石复配无论是菌体还是活体均可起抑制作用;在活体试验中，小檗碱与复硝酚钠、芸薹素内酯复配使用可增加复配成分对番茄灰霉病菌的防效，实验室平板试验反而促进番茄灰霉病菌的生长。复硝酚钠、芸薹素内酯作为新型绿色环保植物生长调节剂，在活体状态下[18]可促进蔬菜、瓜类、水果等作物生长，改善品质，提高产量，说明小檗碱可与复硝酚钠、芸薹素内酯同时使用，小檗碱与不同成分复配不仅通过抑制菌体生长来起到抑菌效果，有可能通过其他间接作用于活体。

本研究采用共毒因子法发现小檗碱和山豆根复配最优配比为0.279 9 mg/mL小檗碱+2.257 mg/mL 10%山豆根，此时共毒因子为33，具有协同增效的作用。山豆根主要活性成分为生物碱类、黄酮类、三萜皂苷类[19]，蔡锦源等[20]发现其有很好的抗氧化及抑菌活性。通过电镜观察，推测小檗碱和山豆根复配使用的抑菌机理可能是损坏了菌体的细胞膜，导致细胞凹陷胞内物质外泄，扭曲折断无法正常代谢。

0.155 5 mg/mL小檗碱+0.062 5 mg/mL炉甘石复配对灰霉病菌的抑菌效果最好。炉甘石[10，21]主要成分为碳酸锌、氧化钙，很多研究发现其有收湿敛疮等功效，然而炉甘石的水溶性较差影响其功效的发挥。通过电镜观察，推测小檗碱和炉甘石复配使用的抑菌机制可能是收敛了真菌细胞的水分，导致细胞缺水无法进行正常的生长代谢，从而干瘪、脆弱易断。

目前，关于植物源农药抑菌机制的报道还很少。后期会在寻找广谱抑菌物质的同时探索药物作用靶点，以期为这些成分单独使用或复配提供适宜、快速的理论指导。

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