曲均革 余诚成 陈月新

摘要 [目的]筛选对农业病害真菌有较强拮抗作用的海洋细菌。[方法]以油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）为筛选模型，采用平皿拮抗法筛选抗菌活性，对活性菌株进行发酵工艺优化，并对活性物质提取进行初探。[结果]海洋细菌菌株MB133具有明显抑菌现象，最优发酵工艺条件为最适培养温度28 ℃，发酵液中最适葡萄糖浓度2.0%，最适培养时间72 h;热稳定性试验表明活性物质对热不稳定;醇沉法提取有效物质发现抑菌组分在沉淀中。[结论]该研究为农用病害真菌的生物防治扩充了菌种资源。

关键词 海洋细菌;农业病害真菌;发酵工艺优化;分离提取

中图分类号 S432.4文献标识码 A

文章編号 0517-6611（2019）04-0140-03

Abstract [Objective]To screen the marine bacteria with strong antagonistic effect against agricultural diseases and fungi.[Method]Using Sclerotinia sclerotiorum as the screening model，the antimicrobial activity was screened by plate antagonism method.The optimization of fermentation process and the extraction of active substances from active strains were studied.[Result]The marine bacteria MB133 had obvious bacteriostasis phenomenon.The optimum fermentation conditions were as follows：the optimum culture temperature was 28 ℃，the optimum concentration of glucose in fermentation broth was 2.0%，and the optimum incubation time was 72 hours.Thermal stability test showed that the active substances were unstable to heat.Extraction of effective substances by alcohol precipitation showed that the antimicrobial components were in the precipitation.[Conclusion]This study expanded the strain resources for biological control of agricultural diseases and  fungi.

Key words Marine bacterium;Agricultural diseases and fungi;Fermentation process optimization;Separation and extraction

近年来化学农药的过度使用给人类社会带来了一系列的生态危机和安全隐患[1-3]。相对而言，生物农药对人畜无毒、环境友好并且不容易产生抗药性，所以生物农药是未来农药发展的希望和方向[4]。 海洋微生物因其具有繁殖迅速、容易大规模培养以及所含次生代谢产物结构新颖、生物活性独特等特点而备受青睐[5-7]。真菌侵染引起的植物病害位于植物病害起因的首位，它导致农作物大量减产。油菜菌核病是油菜生产中的重要病害之一，发病率高达10%～30%，严重的达80%以上，病株一般减产10%～70%，其病原菌属子囊菌亚门真菌[8-11]。笔者以油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）为筛选模型，开发具有抗农业病害真菌特性的海洋细菌资源，以期为农用病害真菌的生物防治扩充菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 海洋细菌菌株。已筛选的海洋细菌菌株MB133为实验室从宁波象山海域分离纯化到的菌种资源[12]。

1.1.2 供试农业病害真菌菌株。油菜菌核病菌（ACCC 37700）来源于中国农业微生物菌种保藏中心。

1.1.3 培养基。

1.1.3.1 富集、活化、发酵培养基。采用2216E液体培养基加葡萄糖20 g/L。2216E液体培养基：蛋白胨5.0 g/L、酵母膏1.0 g/L、磷酸高铁0.01 g/L，人工海水定容至1.0 L，pH 7.6～7.8。

1.1.3.2 农业病害真菌培养基。采用PDA培养基：马铃薯提取液1.0 L、葡萄糖20.0 g、琼脂15.0 g，自然pH。其中马铃薯提取液是取去皮马铃薯200.0 g，切成小块，加水1.0 L，煮沸30 min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0 L。

1.2 方法

1.2.1 获得海洋细菌MB133单菌落。在灭菌过的超净工作台内，用接种环取一环保藏的海洋细菌菌株MB133，将其在2216E培养基上分区划线，生化培养箱内28 ℃培养16 h得单菌落。

1.2.2 活化分离得到的海洋细菌。在灭菌过的超净工作台上，用接种环取海洋细菌菌株MB133的单菌落，放入1 mL无菌海水内将其打散，倒入含0.5%葡萄糖的2216E液体培养基（30 mL）中，放在25 ℃、170 r/min条件下恒温摇床培养16 h，为种子液。再将种子液按2%的接种量接入含0.5%葡萄糖的2216E液体培养基中，25 ℃、170 r/min条件下恒温摇床培养48 h，观察其活化情况。

1.2.3 发酵条件优化。在250 mL三角瓶中进行液体发酵，将种子液按2%的接种量接入2216E液体培养基中，25 ℃、170 r/min培养48 h。改变某一条件，并保持其他发酵条件不变，通过测量菌株的抑菌圈，研究葡萄糖浓度、发酵温度及发酵时间对农业病害菌抑菌效果的影响。

1.2.3.1 葡萄糖浓度对抑菌活性的影响。将菌株活化24 h的种子液，按2%的接种量，接种于含0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%葡萄糖的2216E液体培养基中（30 mL），pH 7.5～7.8，25 ℃、170 r/min培养48 h，测定葡萄糖浓度对油菜菌核病菌抑菌效果的影响，确定最佳发酵糖浓度。

1.2.3.2 发酵温度对抑菌活性的影响。将菌株活化24 h的种子液，按2%的接种量，接种于2216E液体培养基中（30 mL），pH 7.5～7.8，分别在25、28、30、32 ℃，170 r/min培养48 h，测定不同培养温度对油菜菌核病菌抑菌效果的影响，确定最佳发酵温度。

1.2.3.3 发酵时间对抑菌活性的影响。将菌株活化24 h的种子液，按2%的接种量，接种于2216E液体培养基中（30 mL），pH 7.5～7.8，放入25 ℃培养箱，170 r/min分别培养24、48、72 h，测定发酵时间对油菜菌核病菌抑菌效果的影响，确定最佳发酵时间。

1.2.4 离心发酵液。取活化后的MB133菌液2 mL于离心管中，于4 ℃、13 000 r/min条件下冷冻离心10 min，取其上清液。

1.2.5 抑菌活性测量。用接种铲将固体培养基上生长的油菜菌核病菌接种至PDA平板正中间（菌落直径为7～8 mm），在每块平板下方用记号笔划出6个相等的区域，每个区域做好标记。用镊子夹取牛津杯放在每个标记区域的正中间，用移液枪向牛津杯中加入200 μL发酵上清液，每个处理3个重复，25 ℃生化培养箱中培养6 d，测量抑菌圈直径。

1.2.6 抑菌物质的热稳定性研究。将提取得到的发酵上清液平均分为6份，分别置于40、60、80、100和120 ℃高温高压下水浴1 h，并用平皿拮抗法测量是否有抑菌现象，对照为不做处理的发酵上清液。

1.2.7 醇沉法提取活性物质。将发酵液于4 ℃下13 000 r/min离心，上清液和无水乙醇按1∶3混合，再离心，将上清液旋转蒸发除去乙醇，然后将其与用无菌水溶解后的沉淀用平皿拮抗法测量是否有抑菌现象，对照为不做处理的发酵上清液。

2 结果与分析

2.1 发酵条件优化

2.1.1 葡萄糖浓度对抑菌活性的影响。由图1可知，25 ℃培养48 h后，2.0%葡萄糖浓度的发酵液抑菌活性最强，抑菌圈直径12 mm，所以最佳葡萄糖浓度为2.0%。

2.1.2 发酵温度对抑菌活性的影响。培养48 h后，离心取上清，采用平皿拮抗法对油菜菌核病菌进行抑菌活性比较。由图2可知，当温度为28 ℃时，抑菌圈直径最大，可以达13.8 mm，故最佳发酵温度为28 ℃。

2.1.3 发酵时间对抑菌活性的影响。由图 3可知 ，MB133菌株产生抑菌活性物质随时间的延长而增加，24 h抑菌圈直径为0，48 h抑菌圈直径为8.50 mm，72 h抑菌圈直径达12.15 mm，菌株产生的抑菌物质最多，因此确定72 h为最佳发酵时间。

2.2 有效抑菌物质的热稳定性 由图4可知，当温度超过40 ℃后就没有抑菌圈出现，所以有效抑菌物质对热不稳定。

2.3 用醇沉法提取有效物质 发酵液上清经无水乙醇提取，对提取液上清及沉淀分别进行抑菌活性检测，如图5所示，只有沉淀和对照出现了抑菌圈，即沉淀对油菜菌核病菌具有抑制作用，所以有效抑菌物质在沉淀中。

3 结论

该研究所用菌株MB133是从宁波象山海域分离纯化到的海洋细菌，经平皿拮抗法筛选后发现其对农业病害真菌具有较明显的抑菌作用。经发酵条件优化发现最适培养温度为28 ℃，最适葡萄糖浓度为2.0%，最适发酵时间为72 h;热稳定性试验表明活性物质具有热不稳定性;醇沉法提取有效物质发现抑菌组分在沉淀中。下一步将深入开展抑菌组分的分离提取研究，以期为农用抗生素的推广和应用奠定基础。

参考文献

[1] WAN M T.Ecological risk of pesticide residues in the British Columbia environment：1973-2012[J].Journal of environmental science and health，part B：Pesticides，food contaminants，and agricultural wastes，2013，48（5）：344-363.

[2] HOU B，WU L H.Safety impact and farmer awareness of pesticide residues[J].Food and agricultural immunology，2010，21（3）：191-200.

[3] 包永明.浅论大量使用化学农药的负面效应及对策[J].生物学教学，2002，27（9）：30-32.

[4] 邱德文.生物农药的发展现状与趋势分析[J].中国生物防治学报，2015，31（5）：679-684.

[5] BERNAN V S，GREENSTEIN M，MAIESE W M.Marine microorganisms as a source of new natural products[J].Advances in applied microbiology，1997，43：57-90.

[6] DONIA M，HAMANN M T.Marine natural products and their potential applications as anti-infective agents[J].The lancet infectious diseases，2003，3（6）：338-348.

[7] MAYER A M S，RODRIGUEZ A D，BERLINCK R G S，et al.Marine pharmacology in 20078：Marine compounds with antibacterial，anticoagulant，antifungal，antiinflammatory，antimalarial，antiprotozoal，antituberculosis，and antiviral activities;affecting the immune and nervous system，and other miscellaneous mechanisms of action[J].Comparative biochemistryand physiology part C：Toxicology & pharmacology，2011，153（2）：191-222.

[8] 高雪，唐凱健，王利华，等.我国油菜菌核病综合治理研究进展[J].中国植保导刊，2009，29（6）：15-18.

[9] 周乐聪.油菜菌核病流行与防治的研究概况[J].中国油料，1994（S1）：101-108.

[10] 马桂珍，李世东，张拥华，等.核盘菌重寄生菌链孢粘帚霉HL-1-1菌株的生物学特性研究[J].植物病理学报，2004，34（4）：307-313.

[11] 郑露，丁颜敏，姜道宏，等.生防菌盾壳霉ZS-1菌株对油菜菌核病的田间防治效果[J].植物保护学报，2012，39（2）：191-192.

[12] 曲均革，马佳慧，刘冰雪.产蛋白酶海洋细菌的筛选及产酶工艺优化[J].安徽农业科学，2018，46（4）：93-96.