夏 有 为

(《实验室研究与探索》编辑部，上海 200030)

1 超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统

夏有为(简称夏)：程院士，在第二届高校实验室建设与发展论坛上您讲的超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统，能否给我们做个简单介绍。

程和平(简称程)：好的。2014年“超高时空分辨微型双光子在体显微成像系统” 正式立项。2017年，我们北大分子医学研究所、信息科学技术研究院、动态成像中心、生命科学研究院、工学院联合中国人民解放军军事医学科学院组成的跨学科团队(图1)，经过3年的努力，研究成功了超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统(图2)，实现了双光子显微镜核心部件的微型化，将原本几百公斤的仪器缩减为几十公斤的组合体，核心部件缩减至2.2 g(图3左上)，成为可被自由活动的小鼠戴在头上的观测利器(图3右)。运用该显微镜获取了小鼠在自由行为过程中大脑脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像(图4)。它为脑科学、人工智能学科的研究提供了重要的高端仪器，改变了在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式。可用于在动物觅食、哺乳、跳台、打斗、嬉戏、睡眠等自然行为条件下，或者在学习前、学习中和学习后，长时程观察神经突触、神经元、神经网络、远程连接的脑区等多尺度、多层次动态变化(图5)。当时，这一成果是生物医学成像技术的重大突破，也是我国在自主研发重大科研仪器方面取得的重大进展。曾得到包括多位诺贝尔奖获得者在内的国内外神经科学家的高度赞誉。我们中国终于有了自主研发的、领先学界的实验仪器。

图1 程和平院士跨学科研发团队(从左到右:陈良怡、吴润龙、王爱民、胡炎辉、张云峰、程和平、李京航、宗伟健)

图2 多模态微型化双光子显微镜整机

夏：这台微型化双光子显微镜还有哪些特色？

程：除了核心成果微型化双光子显微镜，我们的各个技术路线上都结出了硕果：

(1)在超快领域：我们发明了快速扫描双光子光片显微镜，它是世界上第一个三轴扫描式的光片显微镜。采用双轴对称高速微机电系统转镜扫描技术，成像帧频已达40 Hz(256*256像素)，同时具备多区域随机扫描和每秒1万线的线扫描能力。

图3 微型化双光子显微镜及头戴该微型显微镜的小鼠

(2)在超深领域：我们搭建的三光子显微镜可以看到近2 mm的深度。

(3)在超分辨领域：我们发表的超灵敏超分辨结构光显微镜是非常出色的成果，横向分辨率达到0.65μm。成像质量与商品化大型台式双光子荧光显微镜可相媲美，远优于目前领域内主导的、美国脑科学计划核心团队所研发的微型化宽场显微镜。

图4 实验中的小鼠及脑成像照片

(4)在超大视场领域：我们也有成果产出。

最主要的突破就是微型化的实现。我们把几十公斤重的双光子显微镜核心部件集合到了2.2 g，其中包括成像、扫描和收集部分，在另一个版本中，也可以包括探测部分。这其中，我们完成了对高性能透镜组等关键部件的微型化设计、制造和集成，取得了突破性的进展；此外，920 nm全正色散掺钕飞秒光纤激光器是我们在国际上首次实现;而专用传导此波段飞秒光束的空心晶体光纤等部件也是我们自主设计和定制的。

920 nm波长的激光能够有效激发GFP，GCaMPs等常见荧光标记分子，在双光子显微成像中应用广泛。920 nm光纤激光器能够产生优质的飞秒激光脉冲，而在激光脉冲通过空心晶体光纤传输到微型化探头的过程中，我们的光纤相当于做成了一个柔性可变的空气通道，能够在最大程度上保持激光脉冲传输过程中不畸变不损耗。

在我们的技术之前，双光子显微镜只能观察死的、麻醉的或者固定的动物。而现在，经过训练的小鼠可以戴着只有2.2 g的探头自由活动。我们可以在不影响实验动物生活质量的前提下，对自由状态下实验动物的大脑进行长时间的观测，分辨率达到细胞，甚至是突触的水平。做到“看一看”小老鼠的脑中是什么活动。用我们这个显微系统可以看到两个小老鼠谈恋爱时，脑子里是怎么活动的，还挺有诗意的。

此外，对于大鼠或者体型更大的实验动物，我们还可以对一个个体进行多探头的观测，可以对不同脑区之间的远距离相互作用进行研究。

在脑科学研究中，在真实场景中对活动中的动物大脑进行观测非常重要，所以，我们的技术将可以为脑科学的发展提供巨大的推动力。“微型双光子显微成像系统”的问世，将建立起今后脑科学研究的新范式，成为研究的标准化方法，为正在蓬勃发展的神经科学提供一个强有力的实验工具。

(未完待续)