汪碧云，伍庭凤，李舒婷，谢琳玲，曾 蕾

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学附属中山中医院，广东 中山 528400；3.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄期女性中较常见的内分泌代谢紊乱性疾病，根据不同的诊断标准，约影响9%～18%的育龄期女性[1-2]。其主要表现为月经失调、多毛、不孕等，常合并胰岛素抵抗（IR）。PCOS发病机制目前尚不明确，涉及到遗传、环境、精神心理因素等多个方面，可能为多因素共同作用的结果。目前对于PCOS的治疗尚无特效药物，多根据患者的具体情况个体化治疗，包括调整月经周期、促进生育、调整代谢等。由于PCOS缺乏特异性西药治疗，越来越多的学者关注中医中药对PCOS的防治。

中医古籍没有关于PCOS病名的记载，但根据其临床表现，可归为“月经过少”“月经后期”“闭经”“崩漏”以及“不孕”等范畴。现代中医各医家对PCOS的治疗略有差异，但其病机之本多责之于肾、肝、脾，缘此三脏功能失常，致冲任失调、痰壅胞宫、瘀血阻络而发为本病。丹栀逍遥散原方出自明代薛己的《内科摘要》，其方根据《太平惠民和剂局方》中的逍遥散加减而来，具有疏肝清热、养血健脾之功效，主治肝郁血虚内热证。临床多用于PCOS肝经郁火证，该证型的患者多有高雄激素的表现。动物实验证明该方能降低PCOS模型大鼠的抗米勒管激素（AMH）及雄激素（T）的水平，并能改善PCOS的IR情况[3-4]。但由于中药复方药物多且成分复杂，其具体的作用机制尚不明。因此需要系统地研究药物、化合物、蛋白、基因及疾病的相互作用过程，以进一步明确该方的药效物质基础及作用机制。本研究基于网络药理学的方法，查找丹栀逍遥散的活性成分，并预测其作用靶点，通过建立药物——疾病靶点的网络图，探索丹栀逍遥散治疗PCOS的作用机制，为中药复方的机制论证提供新思路。

1 材料与方法

1.1 丹栀逍遥散活性成分筛查 丹栀逍遥散的主要方药组成包括牡丹皮、栀子、当归、白芍、柴胡、茯苓、白术、甘草等，在中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP[5]检索上述各味中药，得到相关活性化合物后，以药物口服生物利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18为条件进一步筛选。将最终得到的活性成分导入化学信息数据库Pubchem[6]，检索各个活性成分的规范SMILES结构和化学结构式。

1.2 丹栀逍遥散潜在靶点的预测 将各活性成分的结构导入到Swiss Target Prediction[7]数据库，限定物种为人，预测其作用靶点，根据相关性的高低选取潜在作用靶点。

1.3 PCOS的相关靶点数据构建 疾病靶点的查询基于人类基因数据库GeneCards[8]，以“Polycystic O-vary Syndrome”为关键词搜索。获得相关靶点后，为便于数据分析，使用Uniprot[9]将靶点的Gene Symbol转换成Uniprot ID。转换完成后，绘制药物-疾病靶点的Venn 图（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），得到药物作用的潜在靶点。

1.4 构建靶点-靶点相互作用（PPI）网络图 将丹栀逍遥散作用与PCOS的潜在靶点导入String数据库构建PPI网络，对于无相互作用的靶点予以剔除，将全节点关系信息导入到Cytoscape构建网络图，使用Network Analyzer插件分析网络图，以Degree值大小对各靶点进行排序，取Degree＞10的核心靶点重新构建PPI图。

1.5 靶点的信号通路分析和生物信息富集分析 通过DAVID数据库对核心靶点进行生物学过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及细胞成分（cellular component，CC）的 GO 分析；并利用Cytoscape里的ClueGO联合CluePedia插件进行KEGG分析。以此明确丹栀逍遥散治疗PCOS的相关生物信息及调控通路。

2 结果

2.1 丹栀逍遥散活性成分筛查 在TCMSP数据库检索丹栀逍遥散各味中药，共获得1 081个活性成分，根据DL及OB进一步筛选后，最终得到162个活性成分，其中牡丹皮8个，柴胡16个，栀子15个，白芍12个，白术2个，茯苓15个，甘草92个，当归2个。去除无化学结构式及未预测到靶点的活性成分，以及删除重复项后，最终得到142个有效活性成分，构建药物及活性成分网络图，其中粉色的节点为药物共有的活性成分（如图1所示）。

图1 各个药物的活性成分网络图（粉色为共有的活性成分）

2.2 潜在靶点预测 对活性成分进行靶点预测后得到483个靶点。在Gene Cards数据库检索到PCOS相关靶点共3 619个。在Uniprot数据库中限定物种为人，由于客观未知原因，最终疾病靶点有3 451个成功转化ID。用Venn图分析疾病与药物靶点，得到140个药物作用的潜在靶点。将潜在靶点导入String数据库构建PPI网络，将PPI网络中全节点关系导入到Cytoscape，使用Network Analyzer对网络进一步分析，将Degree≤10的节点剔除。对剩下的84个核心靶点进一步分析，得到网络图2。

2.3 丹栀逍遥散作用于PCOS的核心靶点的网络分析 利用DAVID数据库对核心靶点进行GO分析，设置最小基因富集单位为2，以P＜0.05为有意义，最终得到 286个BP、81个MF和 34个CC。利用Cytoscape对其进行KEGG富集，设置Kappa score为0.4，最小富集单位为3，筛选P＜0.05的结果，最终得到83条通路，包括卵巢类固醇生成、磷脂酰肌醇3激酶 /蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、IR信号通路、雌激素信号通路、子宫内膜癌等通路（图3）。为进一步探索丹栀逍遥散治疗PCOS的相关通路作用机制，通过KEGG中的KEGG Mapper，把核心靶点映射到相关通路中，最终得到多个通路图，图4为其中的一条卵巢类固醇激素生成通路图，绿色标识为丹栀逍遥散的核心靶点。

3 讨论

丹栀逍遥散为中医古籍的经典方剂，但和其他中医方剂一样，中药成分的复杂性导致其难以解释药物治疗疾病的具体作用机制。通过生物信息学构建药物和疾病的互作网络，整合药物作用的靶点，对药物的作用机制及开发有一定的指导意义。

图2 药物与疾病核心靶点交互作用的PPI网络

图3 Cytoscape中ClueGO对核心靶点富集出的KEGG通路图

图4 卵巢类固醇激素生成通路图，绿色标识为本研究中的核心靶点

丹栀逍遥散作为治疗PCOS常用的方剂之一，对于PCOS以高雄激素血症为主要表现的患者有较好的治疗效果，本研究运用网络药理学的方法探索本方疗效的物质基础和分子机制。

3.1 化合物作用靶点 目前已经有关于本方中关键化合物对PCOS的作用机制研究。槲皮素（quercetin）是一种黄酮类化合物，为柴胡、栀子、牡丹皮及甘草的共有的化合物。已经证明槲皮素可以促进肝脏己糖激酶（HK）和葡糖激酶（GK）活性，并降低 PCOS大鼠白介素 1β（IL-1β）、白介素 6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平，改善大鼠的胰岛素抵抗（IR）状态[10-11]。它还可以增加PCOS模型大鼠子宫的雌激素受体α（ERα）和葡萄糖转运蛋白 4（GLUT4）基因的表达[11]，这可能是PCOS合并不孕的新的治疗方向。同样在人体也已经证明口服槲皮素可以通过上调脂联素受体和激活AMP激活蛋白激酶（AMPK）改善患者的IR状态[12-13]。

芍药苷（paeoniflorin）可以抑制大鼠卵巢睾酮的合成，并对刺激大鼠卵巢芳香酶活性以促进雌二醇合成[14]，还能促进脂肪细胞腺苷的释放，激活腺苷A1受体，增加葡萄糖的摄取[15]。

黄芩苷（baicalin）可以通过抑制PCOS模型大鼠的卵巢HSD3B2基因表达，降低雄激素的生成[16]，还能上调葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）和GLUT4的表达，刺激肝细胞对细胞外葡萄糖浓度的瞬时响应和长期响应，对葡萄糖转运进行精细调控，从而改善肝IR状态[17]。

茯苓酸（pachymic acid）可以调节IL-6、TNF-α抑制PCOS的炎症状态，减少氧化应激，改善IR，减少卵巢颗粒细胞的凋亡，促进卵泡发育[18]。藏红花酸（crocetin）作为一种天然类胡萝卜素，能改善肥胖诱导的IR[19]，还可以调节PCOS小鼠的动情周期，恢复其紊乱的激素水平，从而促进排卵[20]。

以上各类化合物以及其他山柰（kaempferol）、柚皮素（naringenin）等均能通过不同的途径改善PCOS的高雄激素血症/IR/低度炎症情况，体现了丹栀逍遥散治疗PCOS多成分、多靶点的特点。

3.2 核心靶点的富集分析 对核心靶点的GO富集分析提示丹栀逍遥散作用于PCOS可能与甾体激素合成、细胞增殖、氧化还原等多个BP过程有关。MF层分析其涉及到酪氨酸激酶、类固醇激素、ATP等；CC层面分析提示其涉及到细胞膜、内质网膜、细胞质、受体复合物及膜筏等多细胞成分。

在对核心靶点的KEGG富集分析中，进一步体现了丹栀逍遥散通过多个通路对PCOS产生作用，包括氧化应激、激素合成、代谢等多个方面，涉及到PI3K/Akt、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、甾体激素合成及胰岛素等多个信号通路。

IR作为PCOS病机的关键之一，不仅存在于PCOS患者的外周组织中，同时也表达于卵巢及子宫内膜局部，降低患者的受孕机率并增加流产风险。胰岛素信号传导通路主要有2条，一条为PI3K/Akt途径。当胰岛素与胰岛素受体结合，促进胰岛素受体底物（IRS）磷酸化，进而激活PI3K，生成第二信使PIP3，激活下游的Akt，调节糖代谢。PCOS患者的胰岛素受体底物-1（IRS-1）介导的PI3K活性下降以及葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）减少，造成IR状态[21]。同时，PCOS-IR患者的胰岛素可能通过PI3K/Akt通路促进子宫内膜的异常增生[22]。另一条为丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）促有丝分裂通路。当PCOS-IR时，2条信号通路失衡，MAPK/ERK活化，导致PI3K/Akt信号通路缺陷，可以进一步促进IR 形成[23]。

目前的研究已经证实PCOS患者存在代谢性炎症状态，且其代谢性炎症可进一步促进患者的代谢紊乱。而PI3K/Akt通路不仅与PCOS的胰岛素代谢有关，还与PCOS患者的炎症及氧化应激状态相关，Zhao等人[24]利用特异性抑制剂探索 NF-κB、Akt、JNK、Erk1/2等通路，发现WNT5a主要依赖于PI3K/Akt/NF-κB信号通路诱导PCOS患者的炎症及氧化应激。

高雄激素血症表现的痤疮、脱发、油脂分泌旺盛等中医多辨证为肝郁化火，治以丹栀逍遥散多有疗效。已用实验证明丹栀逍遥散能降低PCOS瘦素水平，抑制AMH分泌等，从而改善高雄激素血症[3，25]。另外根据关键靶点的KEGG通路图所知（如图4所示），丹栀逍遥散降雄的机理可能与 CYP17、CYP19A1、CYP1B1、17β-HSD 等有关。CYP17主要调节17α-羟化酶和17，20-裂解酶活性，为雄激素合成的关键酶。PCOS患者的17α-羟化酶活性增加而17，20-裂解酶活性下降，致使两者活性失调从而引起雄激素合成增加[26]。CYP17可能为丹栀逍遥散作用的重要靶点之一，具体需待进一步实验认证。

综上所述，网络药理学结果提示丹栀逍遥散在治疗PCOS上共涉及到142个活性成分、84个核心靶点，其作用机制包括甾体激素合成、氧化还原等，涉及到卵巢类固醇生成、PI3K/Akt、IR等多个信号通路，体现了中药治疗疾病的多中心、多靶点、多途径的作用特点。本研究涉及到的部分靶点及分子机制已被相关研究证实，另有一部分挖掘出的靶点及相关通路可作为下一步研究的理论基础，为丹栀逍遥散的作用机制的进一步研究提供方向。