黄瓜基因组DNA的提取方法筛选与优化研究
2019-06-10赵春梅郭晶
赵春梅 郭晶
摘要：本试验以黄瓜叶片为材料进行基因组DNA提取，优化提取高质量黄瓜基因组DNA技术。采用CTAB和SDS两种提取方法试验，琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示：CTAB法去多糖的效果好，提取的DNA纯度高。进一步优化CTAB提取液成分，发现 2% CTAB提取缓冲液加pvp和β- 巯基乙醇提取DNA的效果较好，纯度高。
关键词：黄瓜;基因组;提取方法;优化研究
中图分类号： S642.2 文献标识码： A DOI編号： 10.14025/j.cnki.jlny.2019.12.025
不同植物的核酸结合蛋白情况各不相同，因此，植物基因组DNA的制备采取的提取方法不同，再有植物中多酚类合物以及多糖的污染会影响植物DNA的进一步利用，要从富含多酚和多糖植物组织中分离获得高质量的基因组DNA也并非易事。本文使用最常用的CTAB法和SDS法提取黄瓜基因组DNA，以优化提取方法，为黄瓜种质资源保护、鉴定以及分子育种等试验提供技术支持。
1材料方法
称取新鲜黄瓜叶片0.5g，流水冲洗干净、晾干，用液氮研磨成粉末后分别转入1.5ml离心管中，置于-20℃冰箱中保存备用。CTAB提取缓冲液、SDS提取缓冲液的配方，见表1。
1.1 CTAB法和SDS法提取黄瓜基因组DNA
CTAB法：于1.5ml离心管中加入600μl 预热65℃的2 % CTAB提取缓冲液，旋涡振荡混匀，将离心管置于65℃水浴保持30min，每10min轻轻摇晃离心管，使之充分混匀;冷却2min后，12000rpm离心10min，取上清放在新的离心管中，加入600μl氯仿，轻摇离心管使两者混合均匀;12000rpm离心10min，取上清转入含有乙醇的离心管中，将离心管上下摇动，有絮状DNA产生;12000rpm离心5min后，倒掉上清液，底部即DNA沉淀，加入无菌水使DNA溶解，置于-20℃冰箱保存备用。
SDS法：加入600μl 2% SDS提取缓冲液，65℃水浴中保温30min，每10min轻轻摇晃离心管，使之充分混匀，取出后加入0.7倍5mol·L-1KAc，冰浴30min;12000rpm离心10min;取上清转入另一1.5ml离心管中，然后加入600μl氯仿：异戊醇（24∶1）摇匀，室温下12000rpm离心10min;取上清加入2/3倍体积的乙醇，颠倒离心管使混匀，静置10min，12000rpm离心10min;弃上清，室温下晾干加无菌水使沉淀完全溶解，放入 -20℃冰箱中保存备用。
1.2 不同组分CTAB提取液，提取黄瓜基因组DNA比较
将8个研磨好的样品分别加入1.2%CTAB提取缓冲液;2.2%CTAB提取缓冲液和2% pvp;3.2% CTAB提取缓冲液和1%β-巯基乙醇;4.2%CTAB提取缓冲液加1%β-巯基乙醇加2%pvp;5.4%CTAB提取缓冲液;6.4%CTAB提取缓冲液和2% pvp;7.4%CTAB提取缓冲液和1%β-巯基乙醇;8.4%CTAB提取缓冲液加2%pvp加1%β-巯基乙醇;DNA提取步骤同上。
2 结果与分析
2.1 CTAB法和SDS法提取黄瓜DNA的电泳检测结果
图1（A）为CTAB法和SDS法的DNA提取结果比较，1和2为CTAB法提取黄瓜DNA，3和4为SDS法提取黄瓜DNA。由图可以看出SDS法提取的DNA电泳带没有CTAB法的亮，说明DNA含量高，并且对于多糖的去除效果明显。SDS提取的DNA量少，但DNA 纯度较高。蛋白污染需要进一步酚氯仿抽提。考虑到DNA产量问题，认为CTAB法提取要优于SDS方法。
A：CTAB法和SDS法提取黄瓜基因组DNA
B：不同组分CTAB提取液提取黄瓜基因组DNA
2.2 不同组分CTAB提取液提取黄瓜DNA的电泳检测结果
图1（B）显示2% CTAB提取缓冲液提取效果较好，4% CTAB提取缓冲液提取的DNA量很少，几乎没有电泳带，说明4%CTAB不适合用于黄瓜DNA的提取。处理1和2的叶片匀浆翠绿透明;处理3透明但颜色较处理1和处理2 稍暗;处理4较1和处理2暗，但比处理3颜色绿。匀浆颜色绿且透明是DNA 提取质量高的标志。虽然处理A 的叶片匀浆比处理4的更绿，但处理1 中模糊不均一的DNA 条带都有不同程度的拖尾，说明有程度不同的降解，处理2有胶状物聚集于点样孔形成亮带，说明有多糖和蛋白质污染。处理4的DNA条带清晰，且点样孔内没有亮带，说明没有蛋白质和多糖污染，提取黄瓜DNA的效果最好。
黄瓜叶片上的叶脉越多越难研磨，而研磨时间越长，将导致DNA降解和褐化。2% CTAB法提取的黄瓜叶片的DNA带整齐明亮。NaCl、巯基乙醇和可溶性PVP能够有效地去除多糖和多酚类等杂质的干扰;若缺少此步骤，即使用酚、氯仿、异戊醇、NaCl和乙醇等物质多次抽提或沉淀也无法达到理想的纯化效果。使用CTAB法提取DNA时，水浴时间过短会造成DNA得率的下降，如超过1h，则可能会引起DNA的降解，因此，适宜的水浴时间当为40～60min。
3 结论
将CTAB和SDS两种提取方法对比，CTAB法提取出的DNA较纯，产量较高，并且在2%CTAB提取缓冲液中加1% β-巯基乙醇加2%pvp提取效果最好，可用于后续实验。
