柯东平，毛俊倩，刘 琪，郭甲民，马龙安△

1.陕西省肿瘤医院普外科 (西安710061)；2.陕西省杨凌示范区医院普外科(杨凌712100)

结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)具有高发病率、高病死率等特点。国际癌症研究中心(IARC)在2018年9月发布的全球癌症统计数据显示，结直肠癌在所有癌症中发病率排在第三位，癌症相关病死率排名第二位。肿瘤细胞的增殖、生长、浸润与许多基因的突变、异常表达密切相关，研究CRC中相关分子机制并找寻有效分子标记有利于CRC的及早诊断和治疗。TRIM21是三元基序蛋白(Tripartite motif-containing protein, TRIM)家族成员，该家族一般含有RING结构域，具有E3泛素连接酶活性。人类的TRIM21位于第11号染色体上11p15.4区域，共475个氨基酸，包含四个结构域：RING结构域、B-box结构域、Coiled-coil结构域和PRYSPRY结构域。TRIM21最早在系统性红斑狼疮中被鉴定。后来的研究表明TRIM21与多种肿瘤的发生也密切相关[1-3]。研究发现，TRIM21在人肠癌中表达显著降低，TRIM21缺失小鼠结肠癌的发生更明显[5]。本研究将进一步探讨TRIM21在结直肠癌中的作用机制，通过干扰结直肠癌细胞中的TRIM21表达，明确TRIM21对结直肠癌细胞增殖、凋亡及TGF-β1-Smad2/3信号通路活化的影响。

材料与方法

1 试剂与材料 RPMI-1640培养基(Gibco，31800-014)；胎牛血清(BI，04-001-1ACS)；MTT检测试剂盒(万类生物，WLA021a)；细胞凋亡检测试剂盒(万类生物，WLA001c)；Super M-MLV反转录酶(BioTeke，PR6502)；2×Power Taq PCR MasterMix(BioTeke，PR1702)；SYBR Green(Solarbio，SY1020)；TRIM21抗体(Bioss，bs-0635R)；TGF-β1抗体(万类生物，WL01076R)；p-Smad2/3抗体(万类生物，WL02305)；Smad2/3抗体(万类生物，WL01520)CyclinD1抗体(万类生物，WL01435a)；羊抗兔IgG-HRP(万类生物，WLA023)；β-actin抗体(万类生物，WL01845)。

2 实验方法

2.1 细胞培养：人结直肠癌细胞HCT116细胞株用含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37 ℃、5 % CO2、饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养。

2.2 TRIM21 siRNA转染：HCT116细胞常规培养至细胞密度为70 %进行转染。在室温下混合无血清培养基稀释的Lipofectamine 2000和siRNA干扰片段或阴性对照，静置15 min。将上述溶液缓慢滴入培养的HCT116细胞中，不断轻轻振荡，置于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养4 h后换液继续培养。细胞共分三组：未转染组、阴性对照(NC)组、TRIM21 siRNA转染组。

2.3 MTT检测细胞增殖：分别于转染后24 h、48 h、72 h和96 h收集各组细胞，弃去培养基，每孔加入20 μl MTT染色液，置于37 ℃、5 % CO2培养箱中孵育4 h。4 h后小心吸去上清，加入150 μl DMSO，避光静置10 min后用酶标仪测定570 nm处OD值。

2.4 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡：转染后48 h收集各组细胞，离心收集细胞沉淀，用PBS洗涤两次，每管细胞用500 μl Binding Buffer重悬，依次加入5 μl Annexin V-FITC/PI和 10 μl PI混匀，室温避光孵育15 min后上流式细胞仪检测。

2.5 实时荧光定量PCR：分别于转染后24 h、48 h收集细胞，加入TRIpure裂解液提取总RNA，Nano 2000测定RNA浓度。上述RNA样本进行反转录得到对应的cDNA进行后续实验。本实验利用ERxicycler TM96荧光定量仪进行荧光定量分析，引物序列如下：TRIM21-F：5’- GCTCCAGGTGGCATTAGG-3’；TRIM21-R：5’-TGCACAAACTCTGCGTGA-3’；TGF-β1-F：5’-CCTGCCTCCGCTCCTAGT-3’；TGF-β1-R：5’-CATGGAAGATGGCAAATTAC-3’；Smad2-F：5’-CAGTGTTAGATACCCTCTTCGT-3’；Smad2-R：5’-TTGTTCATGTCCACAGACTAGATA-3’；Smad3-F：5’-AGAGGAGTGCTGGTGACTGGAT-3’；Smad3-R：5’-GGAAGGTGCTGAAGACAAGGAT-3’；Cyclin D1-F：5’-GAACACGGCTCACGCTTAC-3’；Cyclin D1-F：5’-CGATACACACAACATCCAGG-3’；β-actin-F：5’-CACTGTGCCCATCTACGAGG-3’；β-actin-R：5’-TAATGTCACGCACGATTTCC-3’。

2.6 Western blot：转染后48 h收集细胞加入裂解液抽提总蛋白，BCA法对蛋白进行定量。取40 μg蛋白进行SDS-PAGE，电泳结束后转膜、封闭；加入相应一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育45 min，之后进行ECL底物显色反应，暗室曝光，胶片用Gel-Pro-Analyzer软件分析光密度值。

结 果

1 TRIM21 siRNA转染效果验证 在转染后24 h和48 h分别通过实时荧光定量PCR和Western blot检测HCT116细胞中的TRIM21在mRNA和蛋白水平上的表达，结果显示，与阴性对照组相比，TRIM21 siRNA转染组中TRIM21在mRNA水平和蛋白水平上的表达均显著下降，差异具有统计学意义(图1)。

图1转染后细胞中的TRIM21表达(A：Real-time PCR检测TRIM21在mRNA水平上的相对表达量；B、C：Western blot检测TRIM21在蛋白水平上的相对表达量与阴性对照组比，**P<0.01)

2 TRIM21 siRNA转染后的细胞增殖 分别于转染24 h、48 h、72 h和96 h后采用MTT检测HCT116细胞的增殖情况，结果显示(图2)，24 h、48 h、72 h和96 h时TRIM21 siRNA转染组细胞活力均高于阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。Real-time PCR检测细胞中增殖相关蛋白Cyclin D1表达，结果显示(图3)，与阴性对照组比，TRIM21 siRNA转染组Cyclin D1的相对表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。

3 TRIM21 siRNA转染后的细胞凋亡 细胞转染48 h后采用Annexin-V/PI法检测细胞凋亡情况，结果显示(图4)，TRIM21 siRNA转染组细胞凋亡比例为(6.27±0.05)%，显著低于阴性对照组的(7.76±0.12)%，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表1。

图2MTT检测转染后的细胞增殖 (与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01)

图3Cyclin D1的相对表达量 (A：Real-time PCR检测Cyclin D1在mRNA水平上的相对表达量；B、C：Western blot检测Cyclin D1在蛋白水平上的相对表达量;与阴性对照组比，**P<0.01)

表1 转染后的细胞凋亡比例

注：与阴性对照组比，*P<0.01

4 TRIM21 siRNA转染后细胞TGF-β1-Smad2/3通路活化情况 在转染后48 h，采用实时荧光定量PCR和Western blot检测TGF-β1、Smad2、Smad3的表达量，结果显示(图5)，与阴性对照组相比TRIM21 siRNA转染组的TGF-β1在mRNA和蛋白水平的表达量均有所下降，差异具有统计学意义(P<0.01)；各组间Smad2/3在mRNA和蛋白水平的表达没有差异，但采用Western blot检测Smad2/3的磷酸化，结果显示TRIM21 siRNA转染组的p-Smad2/3水平低于阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图4 流式细胞术检测转染后的细胞凋亡(A：未转染组；B：阴性对照组；C：TRIM21 siRNA转染组)

图5TRIM21 siRNA转染后HCT116细胞TGF-β1-Smad2/3通路相关蛋白表达 (A：Real-time PCR检测TGF-β1、Smad2和Smad3在mRNA水平上的相对表达量；B、C：Western blot检测TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3在蛋白水平上的相对表达量；与阴性对照组比，**P<0.01)

讨 论

目前的研究已经证实，TRIM21在多种癌症中存在异常表达，在不同的癌症中扮演不同的角色。在CRC中，有研究曾报道了TRIM21与结肠炎相关结肠癌的发生[4]、CRC细胞顺铂敏感性[3]相关。本研究在此基础上探讨了TRIM21与CRC细胞增殖、凋亡的相关性，结果显示在HCT116细胞中干扰TRIM21的表达使HCT116细胞增殖能力增强，同时凋亡细胞比例下降，说明TRIM21在CRC中可能发挥类似抑癌基因的作用，沉默TRIM21的表达使肿瘤细胞增殖能力进一步增强。此外，转染TRIM21 siRNA的细胞中增殖相关蛋白Cyclin D1的表达也显著升高。

TGF-β是一类多功能的细胞因子，通过与受体结合发挥功能。通常TGF-β1首先与TGF-βRⅡ结合，然后再与TGF-βRⅠ结合，形成的具有活性的复合物可以磷酸化Smads蛋白，如Samd1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8等，它们与co-Smad(Smad4)结合形成复合体，该复合体转位至细胞核可以调控下游靶基因的转录[5]。TGF-β1-Smads通路是肿瘤中较为经典的信号通路，在不同类型、不同发展阶段的肿瘤中功能不同，与肿瘤细胞的增殖、转移能力密切相关。一方面，TGF-β1诱导周期依赖性激酶(Cycle dependent kinase, CDK)抑制剂p15的合成，阻止CDK和Cyclin的作用，抑制细胞增殖[6]；另一方面，在肿瘤的发展晚期，TGF-β1信号通路诱导上皮-间质转化，促进肿瘤的侵袭和迁移[7]。在CRC发展期间，TGF-β1的功能也存在类似的变化[8]。

有文献曾报道，TRIM21正调控TGF-β信号通路[9]。本研究主要探讨TRIM21通过TGF-β1通路影响CRC增殖的机制。研究表明，在CRC早期，BAG-1通过抑制TGF-β1促进肿瘤细胞存活[10]；阿司匹林通过诱导TGF-β1抑制CRC细胞增殖[11]。本研究中，在HCT116细胞中转染TRIM21 siRNA后，细胞中的TGF-β1表达量显著下降，同时Smad2/3的磷酸化水平降低，说明干扰TRIM21的表达可以抑制TGF-β1—Smad2/3通路的活化，同时Western blot结果显示细胞增殖相关蛋白Cyclin D1的表达水平也明显下降，Cyclin D1是由p-Smad2/3调控的下游基因之一，提示TRIM21可能通过调控TGF-β1—Smad2/3通路的活化水平进而影响增殖相关蛋白的表达，从而影响CRC细胞增殖和凋亡，参与CRC发展进程。