赵斌 张敏敏 苏子涵 孙凯 藏萃妮 孙璐瑶

（1，潍坊工商职业学院 262200；2，山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200）

水貂出血性肺炎[1]是由铜绿假单胞菌（ Pseudomonasaeruginosa，PA）又称绿脓杆菌引起的急性传染病，多发生于夏季炎热潮湿季节，以出血性肺炎为主要特征，发病急，死亡快，常呈地方性暴发性流行，给养貂业造成较大经济损失。肺炎克雷伯氏菌[2](KlebsIella Peneumoniae) 属肠杆菌科菌属克雷伯氏菌种，典型的条件致病菌，在自然界、人和动物体内广泛存在。当水貂换毛抵抗力下降或本菌大量增殖时，会引起水貂发病甚至暴发性流行。肺炎克雷伯氏菌引起的感染已上升到仅次于铜绿假单胞菌，居革兰氏阴性菌感染的第2位，且两者常呈混合感染。近些年来，由于水貂养殖规模的提高，在山东文登和威海、诸城养殖场发生了大量水貂混合感染肺炎病例。养殖户对抗生素乱用，菌株耐药性不断增强。致使该病危害程度逐年加深，目前该病已成为危害水貂养殖的主要传染病之一[3]。

国内外针对水貂肺炎疫苗研发主要从铜绿假单胞菌出发，往往忽略克雷伯引起的肺炎。本文从克雷伯荚膜多糖作为新型佐剂及其与铜绿假单胞菌制备二联苗出发，通过对小鼠异性抗体水平、抗体水平变化规律、特异性分泌细胞的检测评价，以获得综合预防水貂肺炎二联苗，丰富我国水貂肺炎疫苗的种类。

1 材料

1.1 菌株

铜绿假单胞菌强菌株为ZHDL9、肺炎克雷伯强菌株为K7，均由吉林大学兽医微生物与免疫实验室分离保存。

1.2 试验动物

6 周齢雌性 SPF 级 Balb/c 小鼠（20±2）g，购自长春忆思实验动物科技有限公司。

1.3 试剂

BCA 蛋白定量试剂盒购自Thermo 有限公司；RPMI1640 培养液购自Gbico 公司产品；胎牛血清购自 Hyclone 有限公司；HRP 标记的兔抗小鼠IgG 为sigma 公司产品。TMB 显色液购自天根生化科技有限公司；白细胞稀释液购自弘慈医疗机械有限责任公司。Biotin-protein A 购自博士德生物有限公司。

2 方法

2.1 克雷伯荚膜多糖的提取、纯化

肺炎克雷伯K7 毒株扩大培养，菌液8000r10min 离心、弃上清，加10 倍体积的2dd 水使菌悬浮混匀达到饱和。置入水浴锅 55℃以上 30min，静止一段时间使死菌沉淀。过滤，13000r10min 弃沉淀于终浓度 1%ATCB 吸附。13000r 10min 弃上清融入2MgCL2，13000r 10min 离心弃沉淀。使乙醇终浓度达到25%离心除核酸，使乙醇终浓度达到80%离心弃上清得粗糖。融入饱和的乙酸钠溶液，饱和酚抽提5 次除蛋白，透析去除苯酚。最终至乙醇析出蒸发后既得精糖。通过硫酸—苯酚法测定荚膜多糖的含量，利用紫外分光光度计进行核酸蛋白含量测定，以检测其纯度。

2.2 灭活疫苗的制备

将铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9、肺炎克雷伯强毒株K7 活化接种于液体LB 扩大培养，铜绿假单胞菌菌液避光3d，静止培养。向培养的铜绿假单胞菌菌液、肺炎克雷伯菌液加入终浓度为0.4%甲醛灭活溶液，加入适量无菌的硫代硫酸钠中和活甲醛，随后进行灭活效果检验。既为灭活的铜绿假单胞菌疫苗和克雷伯疫苗；克雷伯荚膜多糖与以灭火铜绿假单胞菌菌体按照一定比例溶解稀释，即为克雷伯荚膜多糖铜绿假单胞菌菌体疫苗；铜绿假单保菌菌液离心收集上清液灭活加入Al（OH)3胶佐剂旋涡均匀，即为铜绿假单胞菌上清铝盐疫苗；灭活的铜绿假单胞菌菌体、灭活克雷伯菌体与Al（OH)3胶佐剂按一定比例溶解，即为铜绿假单胞菌菌体、克雷伯铝盐疫苗；灭活克雷伯菌体与Al（OH)3胶佐剂按一定比例溶解，即为克雷伯菌体铝盐疫苗。经计算小鼠注射抗原量为40ug/只。

2.3 小鼠保护实验

将 80 只 Balb/c 小鼠随机分成 8 组，每组 10 只。分为铜绿假单胞菌培养上清氢氧化钠吸附组、铜绿假单胞菌体氢氧化铝组、克雷伯菌体氢氧化铝组、克雷伯铜绿假单胞菌氢氧化铝组、克雷伯荚膜多糖组、克雷伯荚膜铜绿假单胞菌菌体组、铜绿假单胞菌菌体组、生理盐水对照组。每组小鼠进行肌肉注射，14d 进行二免。二次免疫后 7、14、21d 眼底采血测定抗体水平及其抗体水平变化规律。

2.4 特异性分泌细胞的检测

免疫28d 小鼠眼球取血，400g 离心采集血液，小心弃上清，D-Hanks 洗剂两遍；400g 离心 5min，重悬细胞后加入等量的白细胞稀释液；400g 离心5min，离心后小心吸取淋巴细胞至1.5ml 离心管；用RPMI1640 培养液将细胞浓度调整为107个/ml，将调整好细胞浓度的淋巴细胞铺已经包被抗原的96 孔Eli-sport 板，每孔 100ul（含 106细胞）37℃，5%CO2孵育 20h；小心取孔内液体无菌PBST 洗5 遍每次 5min；Biotin-proteinA分别 1:1500 倍稀释后混匀，小心加入 96 孔板中，每孔100ul37℃5%CO2继续孵育 40min，无菌 PBST 洗剂 3 遍每次5min，每孔加入 100ulTmb 显色液，避光显色 10min，50ul 硫酸终止。细胞显微镜下棕色斑点计数。结果通过棕色斑点计数来判定。

3 结果与分析

3.1 克雷伯荚膜多糖提取、纯化结果

3.1.1 苯酚—浓硫酸法检测精糖含量

图1 葡萄糖标准曲线

图1显示的是葡萄糖标准曲线，纵坐标为吸光度值，横坐标是糖的浓度，单位为ug/ml,回归方程为：y=0.0145x+0.0471,R2=0.942。

由回归方程计算克雷伯荚膜多糖的含量，结果见表1，测定3 次荚膜多糖在OD490处的吸收值，取平均值，带入回归方程，由回归方程得到荚膜多糖的浓度为32.68ug/ml，将此浓度代入多糖含量计算公式，得出多糖含量为40.85%。

3.1.2 核酸蛋白检测仪检测样品中蛋白质和核酸含量

由表2可知，精致物中蛋白质含量大约是0.1%，核酸含量大约是0.08%。证明克雷伯荚膜多糖纯化成功，已将大部分蛋白质和核酸去除。

3.2 小鼠保护性实验结果

3.2.1 小鼠免疫后抗体变化规律

对免疫小鼠进行采血，通过ELISA 方法测定血清中特异性抗体水平变化规律。结果显示，小鼠免疫后第14 天抗体水平达到峰值，在第21 天抗体水平开始下降。第14～21 天抗体含量维持在较高水平，见图2。

表1 多糖含量的测定结果

表2 蛋白和核酸浓度结果

图2 小鼠免疫后抗体水平变化情况

3.2.2 铜绿假单胞菌上清液多组分蛋白疫苗与铜绿假单胞菌菌体疫苗免疫效果比较

将免疫 14、21d 产生抗体小鼠进行特异性抗体水平与Elispot 实验比较结果显示，铜绿假单胞菌上清液疫苗与铜绿假单胞菌菌体疫苗无显著差异结果见图3、4。

3.2.3 荚膜多糖抗原效果评价比较

将免疫14、21d 产生抗体小鼠进行特异性抗体水平与Elispot 实验比较结果显示，荚膜多糖抗体水平高于克雷伯菌体，但作为佐剂自身抗原性较低结果见图5、6。

3.2.4 克雷伯荚膜多糖作为佐剂对铜绿假单胞菌免疫增强效果的评价

将免疫14、21d 产生抗体小鼠进行特异性抗体水平与Elispot 实验比较结果显示，荚膜多糖作为佐剂对铜绿假单胞菌菌体具有增强作用，但产生抗体水平低于氢氧化铝佐剂结果见图7、8。

4 讨论

近几年，我国经济动物养殖业得到迅猛发展，但养殖户的管理理念与管理水平并没有得到相应提高，环境污染、饲养密度过大、空气流通不畅、夏季环境潮湿为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏杆菌致病菌大量繁殖提供良好的条件。同时也是水貂处于换毛免疫力低下时期，两种细菌混合感染制约水貂养殖业发展的主要传染病之一。平常无病不免疫，有病乱投医、乱治疗，致使该菌对多种抗生素耐药。为该病的药物治疗及预防带来极大困难。

目前，国内外铜绿假单胞菌疫苗研制主要应用人医，为基因工程苗、组分疫苗、灭活苗3 大类[3]，对克雷伯引起肺炎不够重视。荚膜多糖是肺炎克雷伯氏菌荚膜的主要组成部分。荚膜具有高度的亲水性、贮存水分、抗干燥是致病菌作为毒力因子重要表面物质，国外报道表明，肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖对强抗原和弱抗原均有明显的佐剂作用，但对免疫原性的报道较少。因此，本实验对荚多膜糖作为佐剂及抗原研究具有重要意义。

本实验表明，荚膜多糖具有良好的抗原性，作为佐剂自身抗原性较差。荚膜多糖作为佐剂对铜绿假单胞菌菌体抗原具有增强作用。铜绿假单胞菌上清液组分蛋白疫苗与菌体疫苗无显著差异，且组分蛋白能很好解决地区血清型的差异性，综上所述，荚膜多糖作为抗原与铜绿假单胞菌上清液氢氧化铝胶体制备二联苗能很好预防水貂肺炎的发生，对控制本病的发生具有重要意义。

图3 铜绿假单胞菌上清液疫苗与铜绿假单胞菌菌体疫苗抗体水平比较

图4 铜绿假单胞菌上清液疫苗与铜绿假单胞菌菌体疫苗特异性细胞分泌水平比较

图5 荚膜多糖抗原抗体水平比较

图6 荚膜多糖抗原特异性细胞分泌水平比较

图7 克雷伯荚膜多糖作为佐剂对铜绿假单胞菌抗体水平的评价

图8 克雷伯荚膜多糖作为佐剂对铜绿假单胞菌特异性细胞分泌水平比较