周剑敏 尹方平 于 晨 汤晓智

(南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心；江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，南京 210023)

高粱籽粒中富含淀粉与蛋白质，其中淀粉质量分数65%～70%，蛋白质质量分数8%～11%。高粱中淀粉比重很高，是我国白酒酿造工业中的重要原料[1]。高粱蛋白质量分数仅次于淀粉，作为酿酒工业中的副产物，其开发利用相对较少。目前报道的高粱蛋白提取方法主要有有机溶剂法[2]、还原剂法[3]、超声波辅助提取法[4]和碱法[5]等。这些方法普遍存在的问题是蛋白质提取率和蛋白质纯度较低，其原因主要与高粱蛋白在高粱中的存在形式和结合结构息息相关。DUODO等[6]和SCHOBER等[7]指出高粱醇溶蛋白位于球形的蛋白质体内，该蛋白质体包埋在谷蛋白基质内，同时周围环绕着淀粉颗粒。这种淀粉-蛋白质的包埋体系限制了高粱蛋白的提取和利用，也导致了高粱蛋白的消化率低，溶解性差。

已有研究证明，挤压技术可以通过破坏淀粉-蛋白质的包埋体系，提升高粱蛋白的消化率和溶解性。FAPOJUWO等[8]报道指出挤压处理能够将高粱蛋白的体外消化率提升至30%。Dahlin等[9]在物料含水量20%，挤压温度为177 ℃，喂料速度为345 kg/h的条件下挤压高粱，结果表明高粱醇溶蛋白在乙醇溶液中的溶解性显著提高，蛋白消化率也增加18%。刘明等[10]研究了双螺杆挤压机处理白高粱粉，研究表明在挤压温度150 ℃，物料水分17%，喂料速度300 g/min,螺杆转速275 r/min条件下，产品的体外蛋白质消化率达到最大值。在挤压过程中，高温、高压、高剪切的条件使淀粉糊化和部分降解[11]，同时打破淀粉-蛋白质的紧密包埋结构[12]，因此有可能进一步通过淀粉酶的处理，有效提取高粱蛋白。

本研究主要探究在挤压过程中物料含水量、挤压温度以及酶处理时高温α-淀粉酶活力对高粱粉中高粱蛋白提取率和纯度的影响，同时利用正交实验优化高粱蛋白的提取工艺，并对提取的高粱蛋白组分进行氨基酸组成测定、营养评价和亚基分析，为高粱蛋白的深度开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高粱、高温α-淀粉酶(40 000 U/g)、Braford蛋白测定试剂盒。

氢氧化钠、盐酸、石油醚、十二烷基磺酸钠(SDS)和2-巯基乙醇均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JXFM110型锤式旋风磨；DSE-20型双螺杆挤压机；SpectraMax M2e酶标仪；D-3紫外检测仪；Cence H850R高速冷冻离心机；KjelFlex K-360凯氏定氮仪；日立L-8900型全自动氨基酸分析仪；MINI-4垂直电泳仪。

1.3 方法

1.3.1 挤压实验

将过60目筛后的微细高粱粉分装后，物料含水量分别调至15%、17%、19%、21%、23%，混合均匀，放入自封袋中平衡过夜。

采用双螺杆挤压机，长径比30∶1，螺杆直径20 mm，模孔直径4 mm。挤压机套筒温度分别设定为Ⅰ区40 ℃、Ⅱ区60 ℃、Ⅲ区100 ℃、Ⅳ区120 ℃，Ⅴ区温度分别设定为 120、135、150、165、180 ℃，喂料器转速恒定为14 r/min，螺杆转速恒定为150 r/min。挤压机启动30 min稳定后，按设定的条件对混合样品进行实验。挤出样品放置于40 ℃烘箱干燥24 h，分别磨粉过60目筛用于后续实验。

1.3.2 淀粉酶法制备高粱蛋白

将未经挤压的高粱粉和挤压后的高粱粉按照料液比1∶6(高粱粉∶超纯水)于90 ℃恒温水浴锅中搅拌，添加适量的高温α-淀粉酶(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4和2.8 U/g淀粉)，反应2 h后，5 000 r/min，4 ℃下离心15 min，倾倒上清液后取沉淀，反复水洗沉淀并离心3次，直至上清液澄清，将沉淀冷冻干燥即得高粱蛋白粉。

1.3.3 高粱蛋白的提取率和纯度的计算

称量冷冻干燥后的高粱蛋白粉的质量，使用Braford蛋白浓度测定试剂盒测定高粱蛋白粉中蛋白质质量分数，计算提取率和纯度，根据式(1)计算：

(1)

式中：m1是冷冻干燥后的所提取高粱蛋白粉质量/g，C1是冷冻干燥后的高粱蛋白粉中蛋白质质量分数/%，即高粱蛋白纯度，C0是高粱或挤压高粱粉中蛋白质质量分数/%，m是高粱或挤压高粱粉质量/g。

1.3.4 正交优化实验设计

根据单因素实验结果，设计L9(33)正交实验。以物料含水量、挤压温度、淀粉酶活力为实验因素，以蛋白质纯度为响应值，因素水平设计见表1。所有实验重复3次取平均值。

表1 正交实验因素与水平

1.3.5 氨基酸分析

准确称取 0.1 g高粱蛋白于水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl，(减压条件下) 密封水解管放入烘箱，110 ℃水解24 h。将水解后的样品过滤，放入圆底烧瓶中旋蒸去除盐酸。残留样品用0.02 mol/L HCl定容至50 mL，吸取稀释后的水解液经0.22 μm滤膜过滤，装入进样瓶中通过氨基酸分析仪测定。采用碱水解的方法测定色氨酸质量分数。

1.3.6 营养价值评价

氨基酸评分(AAS)=

(2)

式中:以1973年FAO/WHO推荐的模式(学龄前儿童)为参考蛋白。

(3)

预测的蛋白质功效比值(PER)：

PERⅠ=-0.684+0.456(Leu)-0.047(Pro)

(4)

PERⅡ=-0.468+0.454(Leu)-0.105(Try)

(5)

PERⅢ=-1.816+0.435(Met)+0.780(Leu)+0.211(His)-0.944(Try)

(6)

1.3.7 SDS-PAGE凝胶电泳

称取50 mg高粱蛋白，加入1 mL缓冲溶液中(0.05 mL 2-ME、0.67 mL 去离子水和0.28 mL混合液，其中含有0.2 mol/L的HCl、7% SDS、30%甘油和4% Pyronin Y)，充分混匀。加入蛋白质样品，150 mA下保持18 h电泳结束[13]。使用考马斯亮蓝染液摇床染色过夜，脱色，扫描凝胶图像。

1.3.8 数据处理和统计分析

采用Origin 8.0和SPSS 17.0数据处理软件对数据进行分析，并用Tukey法进行显著性分析，结果以X±SD表示。

2 结果与分析

2.1 α-淀粉酶法提取高粱蛋白

如表2所示，对未经挤压处理的高粱粉直接进行α-淀粉酶水解处理，发现蛋白提取表现出高提取率和低蛋白质纯度。这说明在高粱中，直接使用α-淀粉酶无法完全水解淀粉。这与高粱中淀粉和蛋白质的结合方式有关。高粱淀粉与蛋白质结合形成包埋结构，淀粉酶难以有效接触淀粉，使得产物中蛋白质依旧与淀粉紧密结合，导致最终产物的提取率高，但蛋白质纯度极低。

表2 淀粉酶法提取高粱蛋白

2.2 挤压协同淀粉酶提取高粱蛋白

2.2.1 物料水分对于高粱蛋白质提取率和纯度的影响

由图1可知，当挤压温度为150 ℃，淀粉酶活力为2.0 U/g淀粉时，高粱粉经挤压协同α-淀粉酶处理后，蛋白质提取率81.48%～83.90%，纯度65.44%～75.77%。相对于α-淀粉酶直接处理，蛋白质纯度提升了4.2～5.2倍。同时提取率保持在较高水平。这与淀粉在挤压机机桶内的糊化和降解相关。淀粉在温度、压力和剪切力的共同作用下发生糊化和降解。淀粉糊化过程中分子间氢键断裂，致密有序的淀粉结构变得松散无序，内部空间增大，在酶水解过程中有利于α-淀粉酶的进入，导致酶解效率增强。这一过程使得高粱中淀粉-蛋白质包埋结构被完全瓦解，蛋白质得以释放，从而能够通过离心沉淀的方式分离得到纯度较高的高粱蛋白。

如图1所示，高粱蛋白的提取率随物料含水量增加呈现先上升后下降的趋势，当物料含水量从 17%上升至19%时，提取率急剧上升。当物料含水量超过19%时，提取率不断降低。蛋白质纯度随物料含水量的变化趋势与提取率的变化趋势一致。在物料含水量19%的条件下，蛋白质提取率与纯度有最大值，分别为83.90%和75.77%。在挤压过程中，物料含水量增加，淀粉充分吸水，淀粉糊化度增加[14]，挤压过程使得淀粉结构松散，从而对α-淀粉酶更加敏感，酶解过程中易于生成小分子量的易溶于水的物质，蛋白质因此在离心过程中沉淀并与淀粉分离开来。同时，水分在机筒中对淀粉等物质有塑化作用[15]，改善物料的流动性，因此，当物料水分含量进一步升高，机械能下降，淀粉的降解程度有所降低，α-淀粉酶水解效率降低，导致提取率降低，蛋白质纯度下降。

图1 物料含水量对蛋白质提取率和纯度的影响

2.2.2 挤压温度对于高粱蛋白质提取率和纯度的影响

如图2所示，当物料水分为17%，淀粉酶活力为2.0 U/g淀粉时，随挤压温度的增加，蛋白质提取率和纯度都呈先上升后下降的变化趋势。挤压温度是影响淀粉糊化和降解程度的重要因素。挤压温度增加，淀粉糊化度增加，α-淀粉酶水解淀粉的效率也随之增大，淀粉-蛋白质包埋结构的破坏程度增加，因此可以得到较高纯度的蛋白质，提取率也升高。在挤压温度150 ℃的条件下，蛋白质提取率达到82.12%，纯度达到75.38%。 但当温度高于150 ℃时，蛋白质提取率和纯度呈下降趋势。过高的挤压温度有可能导致淀粉与脂肪、蛋白质的结合[16]，不利于淀粉酶的水解作用；此外，PHILIPP 等[17]认为挤压温度的增加降低了机筒内熔融体的黏度，物料受到的剪切力下降，挤压过程中淀粉的降解程度降低，α-淀粉酶水解效率降低，蛋白质提取率和纯度降低。随着挤压温度上升到180 ℃，机筒内蛋白质变性程度增加，蛋白质的水溶性降低，还可能产生淀粉的焦化现象，引起蛋白质提取率和纯度的快速下降。

图2 挤压温度对蛋白质提取率和纯度的影响

2.2.3 α-淀粉酶活力对于高粱蛋白质提取率和纯度的影响

如图3所示，当挤压温度为150 ℃，水分为17%时，随着酶活力的增加，蛋白质提取率和纯度呈上升趋势，当酶活力达到 2.0 U/g淀粉之后，蛋白质提取率和纯度变化不大，趋于稳定。α-淀粉酶通过水解蛋白质周围的淀粉，使得更多的蛋白质暴露出来。经过挤压后，糊化的淀粉更易于被α-淀粉酶水解，转化为可溶于水的小分子物质。当底物(淀粉)的量一定时，酶活力的增加提升了淀粉酶与淀粉的接触概率，催化了更多的淀粉水解，从而破坏淀粉分子间结构以及淀粉与蛋白质的包埋结构，导致蛋白质提取率和纯度增加。当淀粉酶活力为2.0 U/g淀粉时，酶与底物的结合达到饱和，继续增加酶活力，蛋白质纯度和提取率趋于稳定。

图3 淀粉酶活力对蛋白质提取率和纯度的影响

2.2.4 挤压协同α-淀粉酶提取高粱蛋白条件优化

根据单因素实验结果设计正交实验，以蛋白质纯度为测定指标。实验结果见表3。

表3 正交实验结果

由表4的方差分析结果可知，F0.1F0.01，酶活力对蛋白质纯度有极显著影响。3个因素对蛋白质纯度的影响先后顺序是C>B>A，即酶活力>物料含水量>挤压温度。综合各因素作用，得到高粱挤压协同淀粉酶法提取获得高纯度蛋白的最佳提取条件是C3B2A3，即淀粉酶活力2.0 U/g淀粉，物料含水量19%，挤压温度165 ℃。在此条件下进行3次验证实验，高粱蛋白质纯度79.23%，提取率83.2%。

表4 SPSS 正交实验方差分析

2.3 高粱蛋白的氨基酸组成分析及营养学评价

由表5可知，挤压协同淀粉酶法提取的高粱蛋白中除了苏氨酸、色氨酸、赖氨酸，其他的氨基酸的AAS均大于1，均能满足FAO/WHO推荐的学龄前儿童的氨基酸需求。赖氨酸、色氨酸等氨基酸的质量分数低是由高粱蛋白的必需氨基酸组成合理性欠缺所引起；苏氨酸的质量分数低与挤压过程有关。在挤压过程中，高温高压条件使得氨基酸残基暴露，并与原料中存在的某些还原糖或羰基化合物发生美拉德反应或非酶促褐变反应，使得氨基酸质量分数下降。相对于杜金娟[5]的研究而言，此法提取的高粱蛋白中亮氨酸、谷氨酸和丙氨酸等氨基酸质量分数均显著提高。这可能是由于杜金娟采用提取方法为碱法提取，其中的蛋白质组成成分主要为高粱谷蛋白，而淀粉酶法提取主要去除高粱粉中的淀粉，提取的高粱中的蛋白质相对较完全。

表5 高粱蛋白氨基酸组分分析

从表6中高粱蛋白的营养评价可知，挤压协同淀粉酶法提取的高粱蛋白中必需氨基酸与总量的比例为38.03%，高于FAO/WHO推荐标准，表现出良好的氨基酸平衡。PER常作为蛋白质吸收利用的评价指标，PER越大其吸收利用越高。挤压协同淀粉酶法提取的高粱蛋白PERⅠ、PERⅡ和PERⅢ均大于2.0，说明本法提取的高粱蛋白氨基酸利用率较高，可以被认为是一种优质蛋白质资源。

表6 高粱蛋白的营养评价

2.4 高粱蛋白的相对分子质量分析

挤压协同淀粉酶法提取的蛋白质(SP2)经过考马斯亮蓝R250染色后的电泳图谱见图4。与Marker对比可以发现，SP2主要有4个条带，其中1条相对分子质量位于24～31 ku，其余3条相对分子质量分别为43、37、15 ku。24～31 ku处的条带范围广，说明此范围内蛋白质亚基较为集中。高粱中醇溶蛋白主要分为3种：α-醇溶蛋白(23～25 ku)、β-醇溶蛋白(16～20 ku)和 γ-醇溶蛋白(28 ku)。这说明SP2 中24-31 ku的条带几乎包含所有的醇溶蛋白组分。Vivas等[18]对蒸煮前后高粱中的谷蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳实验，发现蒸煮前后的高粱中谷蛋白均能在36、45 ku处得到条带，这说明SP2中43、37 ku的条带代表谷蛋白。杜金娟等[19]利用碱法提取甜高粱中的谷蛋白，电泳图在15.1 ku处出现条带并推断此条带是谷蛋白降解所致。所以SP2中的15 ku同样代表了高粱蛋白中的谷蛋白。由此可知，挤压协同淀粉酶法制备的高粱蛋白包含醇溶蛋白和谷蛋白。

现在常用的高粱蛋白提取法有有机溶剂法、还原剂法、超声波辅助提取法和碱法。对这些方法提取的高粱蛋白进行相对分子量分析[19-22]，图谱中均缺少SP2中位于43和37 ku处的条带。这说明相对于现行的高粱蛋白提取方法，挤压协同淀粉酶法能够更加完全的提取出高粱中存在的蛋白质组分。

图4 高粱蛋白的SDS-PAGE图谱

3 结论

研究物料含水量、挤压温度和淀粉酶活力对于挤压协同淀粉酶法制备高粱蛋白的提取率和纯度的影响，并以此为基础，利用正交实验对高粱蛋白的提取工艺进行优化。采用氨基酸分析仪和SDS-PAGE凝胶电泳仪分析本法提取的高粱蛋白。结果发现，随着物料含水量或温度的增加，蛋白提取率和纯度均先上升后下降，在物料含水量19%或150 ℃时有最大值；随着酶活力的增加，提取率和纯度也随之增加，当酶活力2.0 U/g淀粉时趋于平缓。在最佳工艺条件(物料含水量19%，挤压温度165 ℃和淀粉酶活力2.0 U/g淀粉)时，高粱蛋白提取率83.2%，纯度79.23%。本法提取的高粱蛋白包含高粱醇溶蛋白和谷蛋白，并且具有良好的氨基酸平衡和较高的氨基酸利用率。与传统提取工艺相比，挤压协同淀粉酶法绿色高效，有更好的工业化前景。