张 强，罗勤贵，赵南昕，齐雨薇，张 倩，葛武鹏，杨保伟

(西北农林科技大学 食品科学与工程学院， 陕西杨凌 712100)

阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)是一种常见的食源性致病菌，可导致新生儿和免疫力低下人群菌血症、脑膜炎和坏死性小肠结肠炎等疾病，并可引起严重的神经系统后遗症、甚至死亡，致死率高达40%～60%[1-2]。此外，一些肿瘤、糖尿病患者及老年人等感染该菌还可引起脓毒血症，泌尿道、呼吸道、创伤面或局部感染。国际食品微生物标准化委员会已将阪崎克罗诺杆菌列为婴儿配方奶粉的A类致病菌[3]。

目前，虽对阪崎克罗诺杆菌的环境来源尚不清楚，但许多病例报告均表明婴儿配方粉是该菌的主要感染载体，2004年，安徽阜阳劣质婴儿配方粉事件中患者所表现的头部肿大和反应迟钝等临床症状与阪崎肠杆菌感染极为相似，研究结果也证明了该菌和感染间的相关性[4]。同时，研究者也已从乳粉原料[5]、谷物[6]、巧克力[6]、马铃薯粉[6]、婴儿干制食品和配方食品[1,4,7]、意大利面食加工厂和家庭环境中分离出阪崎克罗诺杆菌[7-9]。相对而言，国外对阪崎克罗诺杆菌污染婴幼儿配方乳粉，进而导致婴幼儿感染该菌引起疾病爆发的事件较多，而中国关于市售婴幼儿配方食品中该菌的流行状况及引起疾病爆发的问题却鲜见报道。

本研究调查从陕西省部分超市和妇幼用品专卖店采集的366份婴幼儿配方乳粉、米粉及其他食品中阪崎克罗诺杆菌的流行状况，并对分离株进行药敏性、基因分型和毒力因子检测研究，旨在掌握市售婴幼儿配方食品中阪崎克罗诺杆菌的污染状况及相关特性，为预警与控制该菌流行及风险监测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

婴幼儿配方乳粉、米粉和其他食品共366份，分别采集自陕西省西安市、宝鸡市、咸阳市、武功县、周至县、乾县、礼泉县、扶风县、岐山县和眉县部分超市及孕婴专卖店。其中，婴幼儿米粉220份，婴幼儿奶粉131份，其他品种婴幼儿食品15份。采集的样品基本涵盖了目前市售的国产和进口婴幼儿食品品牌。

阪崎克罗诺杆菌标准株ATCC29544和ATCC BAA-894由河南省疾病预防控制中心提供，药敏性检测标准质控菌大肠埃希氏菌ATCC25922和粪肠球菌ATCC29212为中国药品生物制品检定研究院提供。

Lutia-Bertani(LB)营养琼脂、Mueller Hinton(MH)琼脂、缓冲蛋白胨水(BPW)、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(mLST-Vm)购自北京陆桥技术股份有限公司。TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL2000均购自Takara宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 阪崎克罗诺杆菌分离鉴定 按照国标规定的方法分离检测阪崎肠杆菌[10],采用阪崎肠杆菌特异性引物ompA-F和ompA-R扩增其ompA基因、测序后对菌株进行确定(表1)，检测中以ATCC29544作为阳性对照。获得阪崎肠杆菌后，再使用Stoop等[11]建立的方法从阪崎肠杆菌中鉴定出阪崎克罗诺杆菌。

1.2.2 药敏性测定 供试抗生素分别为：利福平(RIF)、氨苄西林(AMP)、阿莫西林(AMO)、链霉素(STR)、头孢西丁(FOX)、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(TMP/SMZ)、四环素(TET)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、氯霉素(CHL)、萘啶酮酸(NAL)、庆大霉素(GEN)、环丙沙星(CIP)、头孢曲松(CRO)、加替沙星(GAT)、头孢哌酮(CEFO)和左氧氟沙星(LEV)。药敏性测定按照美国临床实验室标准化委员会(the Clinical and Laboratory Standards Institution，CLSI)推荐的琼脂稀释法进行，按照CLSI的规范进行药敏性结果判读[12]。

1.2.3 毒力基因检测 采用煮沸法制备PCR模板。毒力基因检测用引物序列等信息详见表1，由北京奥科生物技术有限公司合成。检测中以ATCC29544和ATCC BAA-894为阳性对照。

PCR反应体系为25 μL。各PCR反应物的浓度及相应添加量分别为：MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2 μL、引物(50 pmol/L)各0.3 μL、TaqDNA聚合酶0.25 μL、模板5 μL，加超纯水至25 μL。扩增条件为94 ℃预变性10 min；94 ℃变性1 min，退火1 min，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min；最后4 ℃条件下保温。退火温度由扩增目标基因引物组成确定(表1)。

使用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。取2 μL PCR产物与适量Loading Buffer混匀，加入琼脂糖凝胶点样孔，以DNA Marker DL2000为对照，100 V恒压电泳30 min。电泳结束后将凝胶移入凝胶成像系统照像分析。

1.2.4 脉冲场凝胶电泳(Pulse Field Gel Electrophoresis,PFGE)分型 PFGE基因分型方法主要按照美国疾病预防控制中心(the Center for Disease Control and Prevention,CDC)推荐的应用于食源性疾病监测网PulseNet中适用于大肠杆菌和沙门氏菌的标准方法进行[13]。

表1 PCR引物及其他参数Table 1 PCR primers and other parameters

注:F表示上游引物，R表示下游引物。

Note:F represents forward primer,R represents reverse primer.

2 结果与分析

2.1 阪崎克罗诺杆菌分离与检测

366份样品中共检出87份阪崎克罗诺杆菌阳性样品，169株阪崎克罗诺杆菌。检出菌株ompA基因PCR检测结果如图1所示。

2.2 阪崎克罗诺杆菌的流行状况

阪崎克罗诺杆菌阳性样品平均检出率为23.8%。131份婴幼儿配方乳粉中检出阳性样品24份，检出率为18.3%。配方乳粉阳性样品全部为牛乳粉，配方羊乳粉中未检出该菌。220份婴幼儿米粉中检出阳性样品60份，检出率为27.3%。15份其他婴幼儿食品中检出阳性样品3份，检出率为20.0%(表2)。

M.DL2000 bp DNA marker，1.ATCC29544(阳性对照) ATCC29544 (positive control);2.阴性对照 Negative control; 3～5.待检菌株 Strain identified

图1 阪崎克罗诺杆菌ompA基因
PCR检测琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agarose based electrophoresis of PCR detection ofompAofCronobactersakazakii

表2 婴幼儿食品中阪崎克罗诺杆菌检出状况Table 2 Prevalence of Cronobacter sakazakii in infant and baby foods

2.3 阪崎克罗诺杆菌的药敏性

168株(99.4%)阪崎克罗诺杆菌对利福平产生抗性，对其他供试抗生素具有抗性的菌株及相应比例依次为阿莫西林20.12%、链霉素18.93%、四环素17.16%、氨苄西林12.43%、庆大霉素11.24%、头孢西丁5.92%、甲氧苄啶/磺胺噁唑5.32%、阿莫西林/克拉维酸4.74%、氯霉素2.96%、加替沙星1.78%、环丙沙星 1.78%、萘啶酮酸1.78%；头孢曲松的菌株最少 (0.59%)。未检测到对左氧氟沙星和头孢哌酮耐药的菌株(表3)。

17株(10.06%)菌对四环素表现出中介耐药，对其他供试抗生素中介耐药的状况依次为氨苄西林5.92%，头孢哌酮5.33%，氯霉素和头孢西丁2.96%，链霉素、环丙沙星和萘啶酮酸2.37%，左氧氟沙星、阿莫西林和阿莫西林/克拉维酸1.18%，利福平0.59%(表3)。

169株阪崎克罗诺杆菌中，48株(28.40%)分离自婴幼儿配方乳粉。该48株菌全部对利福平耐药，对氨苄西林和阿莫西林耐药的菌株比例均为35.42%，对链霉素和头孢西丁的耐药菌株比例均为14.58%，对甲氧苄啶/磺胺噁唑为12.50%。未检出乳粉源分离株对加替沙星、左氧氟沙星和头孢哌酮耐药(表4)。

表3 阪崎克罗诺杆菌的药敏性(n=169)Table 3 Antibiotic susceptibility of Cronobacter sakazakii

注：链霉素的耐药折点参考美国国家抗生素监测网耐药折点值[14]。

Note:The breakpoint for streptomycin referenced to that of the National Antimicrobial Resistance Monitoring System of the United States of America[14].

169株阪崎克罗诺杆菌中，121株(71.60%)源于婴幼儿米粉和其他食品。其中120 (99.17%)株对利福平产生抗性，对氨苄西林和阿莫西林耐药的米粉源菌株比例均为20.66%，对链霉素为14.05%、头孢西丁为13.22%。未检出米粉和其他食品源菌株对加替沙星、左氧氟沙星、头孢曲松和头孢哌酮耐药(表 4)。

2.4 阪崎克罗诺杆菌的多重耐药性

169株阪崎克罗诺杆菌至少可抗1种抗生素，有15株菌(8.88%)至少可抗4种抗生素，4株(2.37%)至少可抗7种抗生素，未检出可抗10种以上抗生素的菌株。12株(63.16%)源于配方乳粉的菌株和7株(36.84%)源于米粉的菌株可抗至少4种抗生素(表5)。

2.5 阪崎克罗诺杆菌毒力基因检测

ompX检出率最高(79.88%)，其次分别为cpa(71.01%)、sip(65.68%)和hly(55.03%)。分离菌株中检测到任何目标基因(表6)。分离株中同时检出3种目标毒力基因的情况最为普遍(32.54%)，同时检出4种毒力基因的菌株比例为28.99%，检出2种毒力基因的菌株比例为 19.53%，检出1种毒力基因的菌株比例最低 (11.83%)(表7)。

2.6 阪崎克罗诺杆菌PFGE分型

对阪崎克罗诺杆菌进行XbaⅠ酶切、PFGE电泳、BioNumerics软件聚类分析后，按照95%及以上同源性，169株阪崎克罗诺杆菌的可被分为4个大簇、8个小簇和1个单一的基因型(图2)。

分离自同一种类婴幼儿食品中的菌株经PFGE分型聚类后基本处于同一大簇。T2、T3、T4、T5、T6、T7、T12和T13等8簇中的菌株均分离自米粉，T9和T10簇中的菌株均分离于配方乳粉，表明源于同一种类的婴幼儿食品中的菌株之间亲缘关系较近。

除了品牌H1和N1源阪崎克罗诺杆菌分离株的基因图谱较为分散外，其他7个主要品牌婴幼儿食品中的菌株的基因图谱分布均比较集中，基本位于同一小簇或同一簇。如：分离自品牌Y1、M1和F1的菌株主要分布在T3簇，分离自品牌Y2的菌株主要分布在T2簇，分离自品牌W1的菌株主要分布在T1簇和T3簇，分离自品牌B1的菌株主要分布在T3簇和T9簇，表明分离于同一品牌婴幼儿食品的菌株具有较高的基因同源性。

表4 阪崎克罗诺杆菌分离株的药敏性Table 4 Antibiotic susceptibility of Cronobacter sakazakii isolates

表5 不同食品源阪崎克罗诺杆菌的多重耐药性Table 5 Multidrug resistance of Cronobacter sakazakii in different foods

表6 阪崎克罗诺杆菌毒力基因检测结果(n=169)Table 6 Results of virulence genes detection in Cronobacter sakazakii

注：cpa为血浆纤溶酶原激活物编码基因，hly为溶血素编码基因，ompX为外膜蛋白编码基因，sip为免疫相关蛋白编码基因。

Note:cpais plasminogen activator gene;hlyis hemolysin gene;ompXis outer membrane gene X;sipsiderophore-interacting gene.

表7 阪崎克罗诺杆菌中同时检出多种毒力基因结果(n=169)Table 7 Results of multi-virulence genes detection in Cronobacter sakazakii (n=169)

3 讨 论

阪崎克罗诺杆菌在食品和环境中分布广泛，具有较强的增殖力、耐热性和耐高渗透压能力，易在食品加工过程形成生物膜[15]。婴幼儿配方粉中极微量的污染(< 3 cfu/100g)就可能大量繁殖，进而导致感染事件的发生[3,16]。2004年10月，Farber[17]在第一届国际食品微生物标准委员会(International Commission on Microbiological Specifications for Foods，ICMSF)中国国际食品安全会议上指出，不同地区阪崎克罗诺杆菌的检出率(0.12%～14.2%)存在明显的不同。

(图续转下页 Be continued in next page)

T1～T13表示PFGE分型后不同的亚型 T1 to T13 stand for different subtypes after PFGE subtyping

自阪崎肠杆菌发现至今，人们对其致病性已有广泛一致的认识，但对其致病机理、流行病学及病原学特性研究尚浅。一些研究显示，即使婴幼儿配方食品的各项指标符合相关国家标准，也有可能被阪崎肠杆菌污染。本次调查结果表明所采集的婴幼儿配方食品均有不同程度的阪崎克罗诺杆菌污染，且检出率较高。由于该菌致病性较强，且主要危害婴幼儿健康，因此国家应制定比较详细且较为严格的检测指标，开发较为快速的检测方法，缩短检测时间，保障婴幼儿食品安全[18]。

研究中婴幼儿配方食品源阪崎克罗诺杆菌分离株的耐药性明显低于徐英春等[19]对临床分离株的研究结果，原因可能是由于该研究中的分离株来自于食品，而临床分离株可能受临床用药的影响较大，产生了较强的耐药性。研究表明，阪崎克罗诺杆菌对β-内酰胺类抗生素、特别是头孢菌素较为敏感，但其对三代头孢(头孢曲松)和四代头孢(头孢西丁)的抗性较裴晓燕等[20]在2007年从婴幼儿奶粉中分离的阪崎肠杆菌的有所提高，表明随着抗生素的广泛使用，存在于婴幼儿食品和环境中的阪崎克罗诺杆菌在长期的进化过程中耐药水平也在逐渐提高。

与其他肠杆菌科革兰氏阴性细菌相比，阪崎克罗诺杆菌的耐药程度总体上较低，这可能与该菌主要属于环境菌而非嗜性寄宿肠道内环境微生物，相比之下发病率较低、治疗性用药较少和该细菌的生物特点等因素有关。但是，阪崎肠杆菌感染婴幼儿后的死亡率可高达50%以上，除儿童的免疫状况外，合理选择和有效应用抗生素，对提高治愈率、降低死亡率是非常重要的措施。研究婴幼儿食品源阪崎克罗诺杆菌的药敏性对控制该菌耐药水平的提高和保障食品安全具有重大意义。

PFGE结果表明，源于同类食品或同一品牌不同批次食品的菌株具有较高的基因同源性，这与裴晓燕等[1]前期对中国市售婴幼儿配方粉源阪崎肠杆菌的基因型研究结果相同。究其原因，很可能是用于生产同类婴幼儿食品时所用的原辅材料(如：淀粉、各种维生素和DHA等)由同一供应商提供，生产环境部分相同或比较相似，从而导致阪崎克罗诺杆菌在生产源头或生产过程对原辅料造成污染，进而在不同品牌的同类食品中检出，分离株在亲缘关系上较为接近。

另外，由于研究中采集的同一品牌的食品样品并非同一批次生产，这就说明该品牌的婴幼儿食品在生产过程可能存在某一环节的不安全问题，导致该品牌不同批次的婴幼儿食品均存在被同一基因型的阪崎克罗诺杆菌污染的可能。食用该品牌婴幼儿奶粉或米粉的婴幼儿如果受到阪崎克罗诺杆菌的侵染而患病，可能会出现相同或相似的症状，或出现集中爆发的趋势。

PFGE聚类结果表明除了几个小簇由于所涵盖的菌株数量较少而无法显示出具有相同或相似基因型菌株的食品品牌多样性特征外，其他各大簇中所包含的阪崎克罗诺杆菌阳性食品品牌种类都不少于8种，表明分离于这些品牌的婴幼儿食品的菌株在不同地域之间的流行比较广泛，在自然界进化过程中可能有着较近的同源关系，或这些不同品牌的婴幼儿食品在生产过程使用了被同一克隆的阪崎克罗诺杆菌污染的同一基料或辅料。例如，T3簇中的14-20(1)为品牌H2的婴幼儿奶粉，但酶切图谱显示它与从品牌为Y2的婴幼儿米粉中分离的14-10(1)之间同源性高达 99.5%以上。在不同品牌的婴幼儿食品中检出具有相同或相似基因型的阪崎克罗诺杆菌表明该菌具有在大范围导致婴幼儿疾病爆发的可能性，应引起相关食品安全检测部门的高度重视。