牛洪梅，戚 成，王 翔，刘 箐，董庆利*

（上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）旧称阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii），是一种自然界中普遍存在的微生物。它能够从多种介质和环境中分离得到，包括食品、奶粉原料、废水、土壤、食品生产线以及家庭和医院等，奶粉和其生产加工环境是该菌传播的主要媒介[1-3]。奶粉中含有丰富的营养物质，阪崎克罗诺杆菌容易在其中存活，进而可能引发一系列食品安全问题。自1958年首次报道阪崎克罗诺杆菌侵害新生儿的案例后，国内外由该菌引发的食品安全事件屡有发生[4-6]。由此可见，奶粉中仍然存在阪崎克罗诺杆菌污染的安全漏洞。为保障消费者安全，有必要深入开展阪崎克罗诺杆菌的风险评估，从而实施相应的食品安全控制措施。

针对奶粉中发生的阪崎克罗诺杆菌污染问题，我国研究者主要致力于利用分子生物学技术对菌株进行新型检测方法的探索[7]。但是为开展阪崎克罗诺杆菌风险控制、保障奶粉的质量安全，还需要充分了解生产、消费过程中微生物的生存状态。本文从生长模型和失活模型两个方面综述了阪崎克罗诺杆菌在预测建模中的最新进展和问题。生长模型反映了环境、历史应激等因素对阪崎克罗诺杆菌生长的影响，失活模型反映了传统、新型致病菌控制技术以及微生物生理状态等对阪崎克罗诺杆菌的作用效果。通过阐述奶粉中克罗诺杆菌在预测建模中的研究方向，以期为克罗诺杆菌相关标准的制定、质量控制和风险管理提供理论支持。

1 阪崎克罗诺杆菌概述

阪崎克罗诺杆菌是一种条件致病菌，属于革兰氏阴性杆菌[8]。虽然阪崎克罗诺杆菌可以被巴氏杀菌有效灭活，但其抗渗透压与干燥能力远超过肠杆菌中其他致病菌，可以在水分活度（aw）为0.2的奶粉中存在2 年[9-11]。研究发现，阪崎克罗诺杆菌对酸也有很好的耐受性，在进入机体后可以经受胃酸等体液的刺激而存活[12]。阪崎克罗诺杆菌的流行病学分析显示，它能引起新生儿和婴儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎等疾病，即使经抗生素治疗后患者也容易遗留严重的神经系统后遗症[13]，而免疫力低下的老年人受到感染后则易导致脾脏脓肿。2004年联合国粮食及农业组织/世界卫生组织将阪崎克罗诺杆菌与沙门氏菌共同列为婴儿配方奶粉中的A类致病菌；2005年，我国将阪崎克罗诺杆菌纳入国家食源性疾病致病菌监测计划，阪崎克罗诺杆菌的安全问题得到监管部门的广泛重视。

2 阪崎克罗诺杆菌的预测建模

预测微生物学或“食品的定量微生物生态学”是一门以工程数学、统计学、微生物学和应用计算机科学为基础的新兴交叉学科[14]，是食品加工中进行微生物控制和食品质量管理的有力工具。其主要运用数学模型对特定环境条件（温度、pH值、aw、防腐剂等）下食源性微生物的生长和失活情况进行定量分析，为食品货架期的预测、质量安全控制和微生物风险评估等提供数据支持[15]。

预测微生物模型分类形式众多。传统上，人们将预测微生物模型分为动力学模型和概率模型。依据微生物的生长、失活状况可以分为生长模型和失活模型。而Buchanan将模型分为一级模型、二级模型和三级模型，该分类方式得到多数研究者的认可[16]。另外，预测微生物学模型根据统计学又可以分为确定性模型和随机性模型。

2.1 生长模型

2.1.1 确定性模型

影响微生物生长的因素众多，其中温度是影响阪崎克罗诺杆菌生长和受污染产品发生相关风险的重要因素之一。早在2006年，Kandhai等[17]用不同生长阶段的阪崎克罗诺杆菌污染复水婴幼儿配方奶粉（reconstituted powdered infant formula，RPIF），阪崎克罗诺杆菌的生长曲线由Gompertz模型进行拟合，结果显示不同生长阶段的阪崎克罗诺杆菌在3.6～47.6 ℃范围内均具有繁殖能力，菌株生长范围较广，表明温度不适宜可使阪崎克罗诺杆菌迅速繁殖并达到足以引起疾病的污染水平。因此，奶粉生产者和消费者必须高度重视卫生条件，严格控制温度，防止病原微生物的生长繁殖。然而，近年来益生菌奶粉因为具有独特的风味、丰富的营养价值等特性，其市场正在逐渐扩大，为了充分保证益生菌的活性，益生菌奶粉的冲调温度通常建议为37.0～45.0 ℃[18]，该温度恰好适合阪崎克罗诺杆菌的生长，使其成为影响食品安全的重要因素。这应该为研究者敲响警钟，在制定工艺参数时应权衡营养与食品安全的重要性。2016年，Fakruddin等[19]采用Gompertz模型对10.0～40.0 ℃下阪崎克罗诺杆菌的生长进行拟合，经评价后发现Gompertz模型拟合效果好，适合描述不同温度下阪崎克罗诺杆菌的生长，二级模型则采用二级多项式模型来描述温度对生长速率的影响。同样的研究也见于魏奇等[20]在6.0～43.0 ℃下对阪崎克罗诺杆菌生长模型的构建；研究发现Huang模型[21]相对于其他几种一级模型更适合拟合菌株的生长。由此可见，确定性模型能够很好地描述阪崎克罗诺杆菌的生长。然而，当模型的构建是为了对微生物的生长进行预测时，其预测结果可能与真实食品中微生物的实际生长情况存在差异，导致这一现象的原因可能是食品基质的影响或菌株之间的差异性等。因此，在设计和开展旨在评估食品中或模拟食品相关环境系统中阪崎克罗诺杆菌生长动力学的研究时，应慎重选择目标菌株。另外，为保证定量风险评估的准确性，还应充分掌握阪崎克罗诺杆菌生长动力学的种内变异性和环境因素对种内变异性的影响的信息。

aw、pH值和抑菌剂等因素同样对微生物的生长产生极大影响。干燥条件是控制奶粉生产过程中阪崎克罗诺杆菌的重要参数。Lang等[22]通过比较不同干燥处理后阪崎克罗诺杆菌的生长参数，证明底物的干燥速率和干燥后的最终aw是造成菌株不可逆损伤的重要条件，该研究为干燥后病原微生物的监控提供参考。类似地，Zhu等[23]发现阪崎克罗诺杆菌不可在用乳酸、乙酸等有机酸酸化至pH 5的培养基中生长，此研究结果可为酸化奶粉研制提供理论支持。另外，抑菌剂的存在也可对菌株的生长产生影响，很多已有研究都可以证明这一点。例如Shi Chao等采用Gompertz模型来定量描述柠檬醛[24]或者百里醌[25]对胰蛋白胨大豆肉汤培养基（tryptone soya broth，TSB）中阪崎克罗诺杆菌生长的影响，发现柠檬醛和百里醌均可以延长迟滞期，降低比生长速率。为加快抑菌物质在食品中的应用，确保环境因素成为食品安全的辅助工具，模型验证工作刻不容缓。模型验证的主要问题不在于模型对数据的拟合程度，而在于如何准确地模拟微生物对给定环境的响应。综上，利用环境因素降低奶粉贮藏、食用过程中阪崎克罗诺杆菌风险的研究尚处于初级阶段，建议继续加强阪崎克罗诺杆菌的风险建模研究，完善模型验证工作。

另外，菌株在食品工业环境或者食品加工过程中可能会受到一定的应激作用。对于受热应激（60.0 ℃、2 min）的阪崎克罗诺杆菌，Fang Ting等[26]使用Huang模型拟合其在不同温度下的生长曲线。对温度与最大比生长速率的关系选择修正的Huang模型[27]进行描述，数据显示热应激并没有引起最大比生长速率的显著变化。类似的研究也见于Yang等[28]对受热应激、酸应激和干燥应激的阪崎克罗诺杆菌在室温下生长模型的构建，显著性分析表明迟滞期同样没有因为应激作用而发生显著变化。除了迟滞期和最大比生长速率，生理状态也可描述历史应激对微生物的生长作用。生理状态概念由Baranyi等[29]提出，用来描述生长历史对迟滞期的影响。综上所述，虽然目前已经建立了历史应激对群体迟滞期影响的模型，但是关于历史应激与生理状态的关系尚待完善。此外，虽然群体迟滞期的定义已经在微生物学中广泛使用，但应激条件下其与单细胞迟滞期的关系在阪崎克罗诺杆菌研究中鲜有阐述。单细胞生长模型的建立多采用比浊法，利用Bioscreen软件测量的浊度曲线估计微生物的生长参数是一种相对简单的方法[30]，建议将来可结合此方法对低菌量阪崎克罗诺杆菌的生长进行建模。

2.1.2 随机性模型

除了环境因素，微生物的初始污染水平及菌株变异性对其生长也会产生极大影响。据调查，实际流通食品中致病菌的含量通常较低，多数奶粉中阪崎克罗诺杆菌的污染水平小于1 CFU/100 g。此时可以用随机性模型描述较小微生物种群或单个细胞的生长行为[31]。Foods等[32]获得形状参数为5的极值II型（EVIIb）分布是描述阪崎克罗诺杆菌单细胞迟滞期分布的最佳模型，可为国际标准化组织对阪崎克罗诺杆菌标准检测方法的修订提供借鉴。此外，为探究历史应激对单细胞变异性的影响，Xu Yao等[33]将单细胞的迟滞期假设为带有固定形状参数的移位Gamma分布，研究发现热应激使得阪崎克罗诺杆菌单细胞迟滞期的分布向右移动，单细胞迟滞期的变异性随恢复温度的降低而增加。在今后的研究中，考虑微生物的变异性是至关重要的，因为微生物风险评估的可信度是基于其估计最终风险所涉及参数的变异性和不确定性的能力。若奶粉中存在少量迟滞期短的非典型菌株，会缩短食品的保质期、增加消费者的健康风险。另外，为更加精准地估计风险，变异性应纳入剂量-效应模型。

综上所述，确定性模型的结果是由初始条件唯一确定的精确数值[34]，通常用来表示群体微生物的生长。虽然传统模型很容易理解，但是它们没有考虑到菌株之间以及单个细胞之间的差异性，因此确定性模型不适用于描述低菌量或者单细胞水平下微生物的生长规律[31]。随机性建模很好地弥补了传统预测微生物模型进行点估计的不足[35]，该方法的输出结果很好地提供了关于微生物污染分布和超过特定临界水平的概率等信息。在模型的应用上，一级模型中，Gompertz模型因为简便易懂而得到广泛应用，Baranyi模型因为在生长研究中具有较好的拟合效果而被应用于估计最大比生长速率等参数[20]。由于温度在食品生产消费链中波动最大，其成为阪崎克罗诺杆菌二级模型研究最多的因素。利用预测微生物学模型研究不同条件下阪崎克罗诺杆菌的生长可为实际食品病原微生物的监测和控制提供有效信息。不同环境条件影响阪崎克罗诺杆菌的生长模型及参数如表1所示。

表1 部分不同条件下阪崎克罗诺杆菌的生长模型及参数Table1 Growth models and parameters of C. sakazakii under selected conditions

2.2 失活模型

预测微生物学[38-39]试图提供在各种环境条件下的微生物失活模型，例如温度、pH值、aw、抑菌剂和其他新型抑菌技术的作用等。因此，预测模型可以看作是栅栏技术的量化，失活模型及其参数可以反映不同控制方法对微生物的作用强度和效果，也可以反映微生物经历的不同应激条件对其失活的影响。

2.2.1 环境因素对失活的作用

热处理是食品工业和家庭环境灭活微生物并确保良好产品稳定性的优选技术，因此关于阪崎克罗诺杆菌的热失活研究相对较多。温度对微生物失活的影响通常使用一级线性动力学方程获得的D值（在一定的处理环境中或一定的热力致死温度条件下某细菌中每杀死90%原有残存活菌数时所需要的时间）和Z值（灭菌时间减少到原来的1/10或在相同灭菌时间内杀灭99%的微生物所需升高的温度）表示。早在1996年，Nazarowec-White等[9]指出阪崎克罗诺杆菌是肠杆菌科最耐热的成员之一，58 ℃时复水奶粉中阪崎克罗诺杆菌D值为5.45 min；而Breeuwer等[40]发现有些阪崎克罗诺杆菌在58 ℃时D值范围为0.27～0.90 min。同一温度下不同研究中D值差异较大，表明菌株之间耐热性存在差异，但这并不妨碍温度对阪崎克罗诺杆菌的作用效果[41]。从表2中由失活模型获得的参数可见，温度越高D值越小[36,40]，奶粉在复水过程中适当提高环境温度可以有效提高杀菌效果。温度对阪崎克罗诺杆菌的失活研究可为奶粉制造商和婴幼儿护理人员提供奶粉复水温度的理论依据和数据支持。

除了热处理，近年来控制阪崎克罗诺杆菌的新技术也不断发展，利用非热技术控制病原微生物的繁殖逐步成为提高产品质量和保障食品安全的重要策略，而失活模型及其参数成为阐述新技术对微生物作用效果的重要依据。Lee[42]和Osaili[43]等的研究表明，低剂量的γ射线便可有效灭活奶粉中的阪崎克罗诺杆菌，因此可以进一步研究γ射线应用于企业生产的可行性。除了采用传统的线性失活模型表达微生物的失活状况外，非线性模型可以更加精确地阐述新技术对微生物的控制效果，例如Arroyo等[44]采用Weibull模型、Adekunte等[45]采用带有“肩带”的对数线性模型和Bigelow模型将阪崎克罗诺杆菌的失活数据拟合到对应模型以获得失活参数，从而证明了超声处理、高强度脉冲电场技术对菌株的灭活效果。除了动力学模型，随机性模型同样可以很好地对阪崎克罗诺杆菌的失活数据进行拟合。Koseki等[46]建立了一个生存/死亡界面模型，该模型用于确定经高静水压处理后阪崎克罗诺杆菌的生长、失活行为。由于该模型是基于概率的方法所建立，其可以估计微生物达到预期失活效果时的失活条件，同时估计该条件下达预期效果的成功概率。上述模型的研究结果将有助于企业或者管理者同时考虑多个环境因素设定婴儿配方奶粉生产、加工标准。

表2 部分阪崎克罗诺杆菌热失活的线性模型及参数Table2 Liner models and parameters for partial thermal inactivation of C. sakazakii

2.2.2 应激条件对失活的作用

研究发现，微生物在暴露于应激条件之后会通过遗传调节或者生理适应性提高其对于该应激条件或者其他应激条件的抗性，这种现象称为“交叉保护”作用[48]。因此，阪崎克罗诺杆菌在不同条件下的失活状况可能由于遭受了各种应激作用而发生改变。为研究干燥、饥饿、热和冷应激对复水婴幼儿奶粉配方中阪崎克罗诺杆菌的热失活的影响。Shaker等[49]使用线性回归得到受应激与未受应激阪崎克罗诺杆菌的D值和Z值，结果发现干燥和热应激均显著降低了D值，即这两种应激作用均使得菌株对温度更加敏感，耐热性降低。而Chang等[50]研究发现阪崎克罗诺杆菌BCRC 13988的耐热性随着热应激处理时间的延长与热应激温度的增加而增加。其中，温度应激导致耐热性变化依旧通过D值变化来体现。Li Poting等[51]也发现热应激（47.0 ℃、15 min）增强了阪崎克罗诺杆菌对消毒剂的抵抗力。由此可见，“交叉保护”作用可能是应激依赖性的，热应激容易使得微生物抗性增加。不同应激作用对阪崎克罗诺杆菌抗性的影响见表3。若“交叉保护”作用增加阪崎克罗诺杆菌的抗性，则构建更为严格的综合控制方案将是未来控制阪崎克罗诺杆菌污染的主要研究方向。

表3 不同应激处理对阪崎克罗诺杆菌在亚致死条件下的耐受性Table3 Resistance of C. sakazakii under sub-lethal conditions to different stress treatments

综上可以看出，早期阪崎克罗诺杆菌的失活研究多关注温度对阪崎克罗诺杆菌的灭活效果，失活动力学曲线的拟合多采用线性回归的方法，且D值和Z值是研究中的重要参数。随着失活研究的不断深入，Weibull模型或带肩或尾的非线性模型能更好地描述非热失活曲线中出现的“拖尾”和“扫肩”等现象，拟合效果更好。然而，新技术为保持食品营养和感官品质而达不到完全灭菌的目的，容易造成失活曲线的“极端拖尾”，因此，研究者应建立更多合适的模型来描述新技术对阪崎克罗诺杆菌的作用效果。虽然随机性模型在阪崎克罗诺杆菌的失活研究中的使用相对较少，但其更加符合实际的估计栅栏因子对微生物的失活效果，其重要性仍不可忽视。另外，“交叉保护”作用的存在可能增加阪崎克罗诺杆菌的抗性，因此应该研究更高强度的微生物控制技术。综上，失活模型的建立反映了传统、新技术对阪崎克罗诺杆菌的作用效果，只有将有效的微生物控制措施、标准化的生产实践相结合才能有效保障奶粉的消费安全。

3 结 语

目前，预测微生物学研究一般在温度、pH值和aw等恒定环境条件下进行，而奶粉在实际生产、运输、消费过程中aw或温度会因环境条件和人为因素而发生变化，因此在波动aw或温度下建立模型更加具有实际意义。在阪崎克罗诺杆菌预测模型的构建中，传统的平板计数法耗时长、特异性较差，导致微生物计数往往局限于纯培养而不能排除背景微生物的干扰，而宏基因组学测序技术、凝胶电泳技术或聚合酶链式反应等分子生物学技术因为具有特异性强、灵敏度高等优点，可能成为预测微生物研究中的有力工具。此外，由于迟滞期受到环境因素和微生物生理状态的双重影响，而研究者恰好缺乏对食品中所污染的微生物生理状态的明确认识，造成迟滞期的预测难度加大，因此对迟滞期设定一个统一的定义成为迟滞期研究的关键点。近30 年来，预测微生物学研究虽已取得相当大的进展，但模型多为实验室条件下所建立，而食品中微生物的实际生长和失活状况可能受营养物质、背景微生物或者实际生活环境等的影响，因此基于工业条件或者食品背景的模型验证工作不容忽视。今后的研究方向建议如下：

1）在信息共享的大数据时代下，虽然我国在预测微生物学研究领域已取得部分进展，但国外早已推出ComBase预测微生物平台和致病菌模型程序等预测微生物软件，中国自主研发食品预测微生物学软件鲜有推出。因此，微生物学家、数学家、计算机科学家和分子生物学家应积极进行跨界合作，构建既与国际接轨又符合中国国情的界面友好型预测微生物软件，从而为数据分析提供依据。2）科学界和监管部门的主要目标是在国家或者国际区域内控制微生物，从而改善食品卫生条件、提高食品安全水平。建议研究者继续加强阪崎克罗诺杆菌的建模研究，利用剂量-效应模型描述疾病发生概率，为阪崎克罗诺杆菌的暴露评估提供数据支持，指导管理者制定合适的食品安全措施。3）目前，针对阪崎克罗诺杆菌预测微生物学的生长建模研究而言，急需对单细胞状态下阪崎克罗诺杆菌迟滞期进行讨论。由于单细胞变异性的存在，利用概率函数的随机性模型能更加贴近实际地描述阪崎克罗诺杆菌的迟滞期，并且生长环境和历史应激对微生物生长动力学影响不容忽视，因此可利用随机性模型探究热应激、低温胁迫、干燥应激和pH值等环境因子对单细胞状态下阪崎克罗诺杆菌迟滞期的影响。此外，应更加重视低剂量致病菌污染时阪崎克罗诺杆菌的死亡动力学建模。4）近年来，控制病原微生物的新技术不断发展，益生菌在奶粉中的应用研究也逐步走向成熟，奶粉中的营养强化物质及益生菌等均会对致病微生物的存活产生影响，所以构建益生菌与阪崎克罗诺杆菌共存状态下的预测微生物建模将更加具有实际意义。5）在历史应激对阪崎克罗诺杆菌在亚致死条件下耐受性的研究中发现，阪崎克罗诺杆菌中可能存在“交叉保护”作用，但是“交叉保护”作用的产生与菌株、应激条件之间的关系尚待研究，同时，产生“交叉保护”作用的机制也待进一步探讨。