王成强，张 玲

（上海理工大学 光电信息与计算机工程学院，上海 200093）

引 言

一氧化氮(NO)作为普遍存在于脊椎动物各种细胞中的一种无机分子，参与机体内多种生理过程，如血管平滑肌的舒张、免疫防御的调节以及中枢和自律神经的传导等，在生理学、病理学以及药理学中均发挥着广泛的作用[1-3]。因此，近年来对于NO的检测受到越来越多研究者的重视，但由于其化学性质活泼，半衰期短且生理环境下其质量分数变化范围很大，因此，在NO检测中既需要较宽的检测范围，也需要极快的响应时间[4-5]。

现有检测NO的方法有多种，如：利用NO与金属蛋白、金属指示剂或重氮反应，根据前后吸收光谱的变化来检测的光谱法[6]；利用NO的孤对电子自由基特性的电子顺磁共振波普法(EPR)[7]；根据NO与O3或H2O2反应的化学发光法[8]；利用NO被氧化成的反应来检测NO的电化学法[9]；直接与 NO反应或者与NO分解的副产物反应产生荧光的改变来实现检测的荧光检测法[10]等等。不同NO检测方法应用于不同的分析领域，与其他技术相比，荧光检测法具有较好的灵敏度、时空分辨率、选择性和可操作性[11]。科学家们已经研究出诸多用于NO检测的荧光探针，近年其中一种新型二氨基荧光素类NO探针DAF-FM(4-amino-5-methylamion-2'，7'-difluorofluorescein)得到了广泛应用。相对于之前常用的DAF-2荧光探针，DAF-FM在多方面表现出更好的性能，如与NO加合反应而成的荧光产物受pH的影响较小，荧光更加稳定不易淬灭，对NO的检测灵敏度更高等[11]。DAF-FM本身具有很弱的荧光，光量子产率仅为0.005左右，与NO反应后因生成荧光素化合物，发强烈绿色荧光，光量子产率可高达0.81，因此可根据DAF-FM荧光强度的变化来判断NO的相对含量。

纳米金颗粒即尺寸在1～100 nm范围内的金微小颗粒，其制备方法简单，粒径均匀，且化学性质稳定，主要采用物理法和化学法制备[12]。物理法制备纳米金颗粒主要是通过分散技术将块体金转变为纳米粒子，主要包括真空沉积法、激光消融法等。而化学法是以金的化合物为原料，利用还原反应生成金纳米粒子，通过调整反应条件控制颗粒尺寸。基于纳米金颗粒的等离子特性、量子尺寸效应等广泛应用于光催化、光电子学及表面增强光谱等领域[13]，本文采用纳米金颗粒与DAF-FM复合，利用金颗粒的光学增益特性有效提高了NO的检测灵敏度，且该荧光探针可重复使用24次以上，弥补了DAF-FM的单次使用缺陷，实现了NO的可持续重复检测。

1 纳米金颗粒的制备与表征

实验中所用纳米金颗粒是采用激光消融法制得。清洗后的金块固定于烧杯中，加入2 mL的去离子水。纳秒激光通过焦距为50 mm的凸透镜后聚焦到金块表面，金块经激光烧蚀变纳米金颗粒。通过透射电镜(TEM)观察金颗粒及其分布，如图1所示，实验所得金颗粒直径基本小于4 nm，且一半以上直径为1～3 nm。

图1 纳米金颗粒TEM图与尺寸统计分布图Fig. 1 TEM image of gold nanoparticles and the statistical chart of particle size

2 实验结果与讨论

为了研究纳米金颗粒在NO检测中的作用，分别采用DAF-FM和DAF-FM/纳米金颗粒复合材料对与质量分数为1 000 ppm(1 ppm=10-6)的NO进行反应，并采用405 nm激光激发，监测DAF-FM-NO荧光强度随着纳米金颗粒的加入以及反应时间增加而发生的变化。图2(a)中的谱线1为DAF-FM表面刚接触NO时的荧光光谱，光谱2为60 s后的荧光光谱，荧光强度基本稳定且维持在300左右。当检测液中DAF-FM与纳米金颗粒比例为1 ∶ 1时，与质量分数为1 000 ppm的NO进行反应，其荧光光谱如图2(a)中的谱线3和4，其中谱线3为刚通入NO时的荧光光谱，谱线4为NO通入60 s后的荧光光谱。由图可见金颗粒的加入有效地提高了DAF-FMNO的荧光强度，同时，通入NO后的荧光强度有明显的变化，60 s时荧光强度可增大82%。由此可见，纳米金颗粒能够有效放大荧光信号并提升DAF-FM的响应速度及灵敏度。

图2 不同比例的DAF-FM与纳米金颗粒的混合液体对不同质量分数的NO的荧光强度变化Fig. 2 Fluorescence intensity variation of mixed liquids with different ratios between DAF-FM and gold

通过调整DAF-FM与纳米金颗粒之间的比例可进一步提高检测灵敏度。不同比例DAF-FM/纳米金颗粒复合材料对对质量分数为2 ppm、10 ppm及1 000 ppm的NO反应曲线如图2(b)～(d)所示。由图2(b)可知，反应最初5 s内荧光强度迅速增大，尤其当DAF-FM与纳米金颗粒比例为2 ∶ 1时，其荧光强度的增幅最为突出可达12%，增幅远远大于不含金颗粒的DAF-FM。不同比例DAF-FM/纳米金颗粒复合材料对对10 ppm NO的响应见图2(c)，由图可见变化趋势与图2(b)中基本一致，在DAF-FM与金颗粒比例为2 ∶ 1时，荧光强度增强最为显著。同样地，图2(d)为DAF-FM/纳米金颗粒复合材料对对1 000 ppm NO的响应，通过观察折线变化可知，此时DAF-FM与纳米金颗粒最佳配比为1 ∶ 2。由此可见，对于不同质量分数的NO气体检测，DAFFM中金颗粒最佳添加量有所不同，这主要是由荧光增强和荧光淬灭双重效应所导致的。当荧光分子处于金属纳米颗粒附近时，由于金属纳米颗粒表面等离子体局域场增强效应会提高荧光分子的激发效率，产生荧光增强，同时，与金颗粒之间的非辐射能量转移导致荧光分子的量子产率降低，发生荧光淬灭效应。在DAF-FM/纳米金颗粒检测NO的过程中，这两种效应并存，适量的金颗粒可以充分放大DAF-FM-NO的荧光强度，对于荧光的增强高于淬灭，但当金颗粒含量过高时，淬灭效应变得更显著，一定程度上减弱了荧光增强。当NO的质量分数较高时，DAFFM-NO荧光团数量多，产生较强的荧光，此时多数荧光团信号得到同时放大才会有较明显的荧光强度提升，因此需要较多的金颗粒。而当NO的质量分数较低时，DAF-FM-NO荧光团数量少，产生荧光较弱，少量荧光团信号得到放大就能显著改变总荧光强度，因此，少量的金颗粒便可达到最佳效果，金颗粒过量则会导致淬灭加剧。因此在利用金属纳米离子提高DAF-FM检测灵敏度及相应速度时，应结合实际需求调整纳米金粒子的添加量。

为了进一步探究添加纳米金颗粒的DAFFM荧光探针在NO检测中的使用寿命，我们采用比例为1 ∶ 1的DAF-FM/纳米金颗粒复合材料对对质量分数为1 000 ppm的NO进行多次重复检测，每次取5 s时刻的荧光增强幅度，其荧光变化如图3所示，在15次使用之前，荧光增强幅度维持在20%左右，而在15次之后，其荧光增幅在7%左右，到第24次已经无荧光增强。在实际应用中，动物细胞内的NO质量分数远小于1 000 ppm，由此可推断，添加纳米金颗粒后的DAF-FM检测试剂可重复使用24次以上。

图3 DAF-FM与纳米金颗粒比例为1∶1的检测液对质量分数为1000 ppm的NO反应随检测次数的荧光强度的变化Fig. 3 Change in fluorescence intensity with detection times when the liquids with DAF-FM and gold nanoparticles in a ratio of 1∶1 reacted with NO at a concentration of 1000 ppm

3 结论与展望

本文提出了一种基于DAF-FM/纳米金颗粒复合材料对的NO检测方法，显著提高了NO检测的灵敏度，且可多次使用。该方法可以拓展到其他气体的检测中，可为医学诊断、环境监测等提供参考。