张云凤，李嘉敏，王 平

（太原工业学院化学与化工系，山西太原030008）

随着世界经济的快速发展，消耗的能源也越来越多，其中生物资源是一种优质的清洁能源，需要我们加大力度不断开发，将可以利用的清洁能源充分应用到我们的生活中[1]。明胶作为胶原的水解产物，是一种可再生的动物生物质清洁能源，资源量正在不断增加[2]。

然而传统碱法提取制备明胶的工艺，在生产过程中的体系卫生标准控制较为困难，生产时间较长，同时设备较难更新改进，不符合绿色节能生产工艺的大环境要求[3]。酶法提取明胶虽然发展时间较短，却在相关的国内外研究中取得较大成果，虽然到目前为止还没能大范围应用于工业生产中，不过其提取时间较短，设备及反应体系更环保及易控制，将是未来明胶提取工艺的重要发展方向[4]。因此，对酶法提取明胶的相关工艺进行探讨和总结具有一定的研究意义和实用价值。

1 实验部分

1.1 材料及仪器

猪皮；胰蛋白酶（阿拉丁试剂公司）；明胶（阿拉丁试剂公司）；其他试剂均为分析纯。

FA2104 型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；JB300D 型强力电动搅拌机（上海标本模型厂）；恒温水浴锅（嘉兴俊思电子有限公司）；TU190 型双光束紫外可见分光光度计（北京谱析通用仪器有限责任公司）；Spectrum 100 型FT-IR 红外（北京谱析通用仪器有限责任公司）。

1.2 猪皮的预处理

将新鲜猪皮洗净，去除猪皮上带有的脂肪，随后将洗净的新鲜猪皮切成1 cm×1 cm 小块，使用浓度为2 mol/L 的氯化钠溶液于1 000 mL 的烧杯中持续搅拌24 h，以除去猪皮中所含的盐溶性及其他可溶性杂质，取出后用去离子水清洗数次；再将处理后的猪皮在丙酮溶液里浸泡12 h 以去除猪皮中的脂类物质[1]，浸泡之后取出并将其清洗干净，放在室温下自然风干，待用。

1.3 明胶标准曲线的绘制

分别精密称取0.500 0、1.000 0、1.500 0、2.000 0 和2.500 0 g 的明胶标准品，在75℃的水浴中溶解于0.5 mol/L 醋酸溶液中，转移至25 mL 的容量瓶中并用0.5 mol/L 的醋酸溶液定容，即分别得到浓度为2%、4%、6%、8%、10%的明胶标准溶液，单位为g/mL。取上述已配制好的溶液，以醋酸溶液为空白样，在波长280 nm 处使用紫外分光光度计进行测试[5]。以胶原浓度为横坐标，以280 nm 处的吸光度值为纵坐标绘制吸光度曲线，得到回归曲线方程。

1.4 胰蛋白酶法提取猪皮中的明胶

将处理后的猪皮浸泡于醋酸溶液中，加入胰蛋白酶，升温反应，酶解，然后，一定温度下提取明胶。提取过程中，溶液中明胶的浓度采用标准曲线法进行测定，根据测试的浓度与溶液体积的乘积比上实验开始时用到的干猪皮重量即得明胶的得率。

明胶的得率Yc由以下公式计算得到：

其中，Vc是明胶提取液的体积，mL；Cc是通过紫外法测得的明胶提取液的浓度，g/mL；Wt是提取使用的干猪皮的重量，g。

1.5 单因素实验步骤

本文探讨的单因素为胰蛋白酶的用量、酶解时间、酶解温度、溶胶温度。

1.5.1 胰蛋白酶用量

称取4 份8 g 干猪皮加入到0.5 mol/L 醋酸溶液中，加入胰蛋白酶的用量分别为0.08 g、0.16 g、0.24 g、0.32 g，调节溶液pH 为7 左右，在35℃的水浴中搅拌12 h，后调节pH 为2～3，反应2 h，使其钝化，再调节pH 到7左右，升高温度到75℃溶胶6 h，用滤布进行过滤，去除未反应完全的猪皮残渣，用离心机离心后取上层清液于比色皿中，根据标准曲线方程求出胰蛋白酶不同用量下干猪皮中明胶的提取率。据此确定酶解温度为35℃，酶解时间为12 h，溶胶温度为75℃条件下的最优胰蛋白酶用量。UV 测试同1.3。

1.5.2 酶解时间

酶解时间分别12 h、24 h、36 h、48 h，采用1.5.1 的方法确定胰蛋白酶用量为0.24 g，酶解温度为35℃，溶胶温度为75℃条件下的最优酶解时间。

1.5.3 酶解温度

酶解温度为15℃、25℃、35℃、45℃的水浴条件下，采用1.5.1 的方法确定胰蛋白酶用量为0.16 g，酶解时间为12 h，溶胶温度为75℃条件下的最优酶解温度。

1.5.4 溶胶温度

溶胶温度为70℃、75℃、80℃、85℃的条件下，采用

1.5.1 的方法确定胰蛋白酶用量为0.24 g，酶解温度为35℃，酶解时间为24 h 条件下的最优溶胶温度。

1.6 正交实验优化工艺

通过对单因素的结果进行分析，将对明胶产率影响较大的因素进行正交优化，然后按照正交优化结果进行实验验证。

1.7 红外测试

打开红外测试仪的开关并预热0.5 h 左右，将实验所得明胶溶液小心地滴在样品板上，盖住盖子扫描谱图，得到谱图后保存，完成后将检测口用棉花沾取工业乙醇擦洗干净[6]。仔细分析所得谱图，得出结论。

2 结果与分析

2.1 明胶标准曲线的绘制

通过实验得到明胶浓度为2%、4%、6%、8%、10%的标准溶液吸光度A，用0.5 mol/L 醋酸溶液作为空白对照，得出表1 数据。

以吸光度A 为纵坐标，浓度C 为横坐标，用最小二乘法进行线性回归，得出明胶吸光度A 与浓度C 的关系曲线的回归方程式为y=1.42x+0.009 8，R2=0.998 5。

表1 标准曲线数据

图1 明胶吸光度A 与浓度C 的标准曲线

2.2 胰蛋白酶用量对工艺的影响

酶解温度为35℃，酶解时间为12 h，溶胶温度为75℃条件下，改变酶的用量进行实验，所得结果如表2。

表2 不同胰蛋白酶用量的提取率

图2 不同胰蛋白酶用量的明胶提取率

图2为不同胰蛋白酶用量的明胶提取率曲线，由图2 可以看出，明胶提取过程中保持酶解温度、酶解时间及溶胶温度一定的情况下，胰蛋白酶用量为0.24 g，即猪皮干重3%（g/g）时明胶的提取率最为理想，在酶浓度较低时酶解效果不理想，当酶浓度过高时提取率也降低。

2.3 酶解时间对工艺的影响

胰蛋白酶用量为0.24 g，酶解温度为35℃，溶胶温度为75℃条件下，改变酶解时间进行实验，所得结果如表3。

表3 不同酶解时间的提取率

图3 不同酶解时间的明胶提取率

图3为不同酶解时间的提取率曲线，由图3 可知：提取过程中保持胰蛋白酶用量、酶解温度及溶胶温度一定的情况下，加入胰蛋白酶后反应时间为24 h 时明胶的提取率最为理想，这是由于酶解时间太短，反应进行不完全；而酶解时间过长，可能会使胶原纤维遭到破坏。

2.4 酶解温度对工艺的影响

胰蛋白酶用量为0.16 g，酶解时间为12 h，溶胶温度为75℃条件下，改变酶解温度进行实验，所得结果如表4。

表4 不同酶解温度的提取率

图4 为不同酶解温度的提取率曲线，由图4 可知：保持胰蛋白酶用量、酶解时间及溶胶温度一定的情况下，当酶解温度为35℃时明胶的提取率最为理想，可能是胰蛋白酶在这个温度下活性最高。

2.5 溶胶温度对工艺的影响

胰蛋白酶用量为0.24 g，酶解温度为35℃，酶解时间为24 h 的条件下，改变溶胶温度进行实验，所得结果如表5。

图4 不同酶解温度的明胶提取率

表5 不同溶胶温度的提取率

图5 不同溶胶温度的明胶提取率

由图5 不同酶解温度的提取率曲线分析可以得出：保持胰蛋白酶用量、酶解时间及酶解温度一定的情况下，溶胶温度为80℃时明胶的提取率最为理想。

2.6 正交实验优化

通过对单因素实验结果的分析，对四个因素中对产率有较大影响的水平进行正交实验，正交助手共提供了九组组合实验，实验条件排列如表6，实验数据如表7。

由以上分析结果可以看出，在胰蛋白酶用量为0.24 g，酶解温度为35℃，酶解时间为24 h，溶胶温度为80℃时，溶液的紫外吸光度A 为0.084，溶液明胶浓度为0.052 2 g/mL，胰蛋白酶对干猪皮的明胶的提取率为67.28%。

2.7 明胶的红外谱图和分析

红外光谱能充分反映官能团与波长的关系，其实质是一种根据分子内部原子间的相对振动和分子转动等信息来确定物质分子结构和鉴别化合物的分析方法[7]。明胶的FT-IR 谱图可以反映蛋白质骨架和侧链基团的特征吸收峰位置及基团的振动模式，并由此推测其构象[8]。

表6 正交实验排列表

表7 正交实验下的提取率

图6 明胶标准品的红外谱图

明胶标准品的红外谱图如图6，由图6 可知：在标准图中，明胶有四个特征吸收峰，分别为3 295 cm-1，2 927cm-1，1 636～1 661 cm-1和1 450～1 230 cm-1，他们分别对应酰胺A 带、酰胺B 的N-H 伸缩振动，酰胺I 的C=O 伸缩，酰胺Ⅱ的C-N 伸缩、N-H 弯曲[7]。图7 为明胶产品的红外谱图，由图7 可以看出，3 366 cm-1和2 928 cm-1附近是N-H 伸缩振动，1 638 cm-1附近是酰胺I 带的C=O 伸缩振动，1 257cm-1是N-H 弯曲振动[7,9]，说明产品为明胶。

图7 明胶产品的红外谱图

3 结论

本实验采用胰蛋白酶法提取明胶，研究了胰蛋白酶用量、酶解时间、酶解温度及溶胶温度四个单因素对明胶提取率的影响，并对影响提取率较大的因素进行正交实验，确定最优的工艺条件为：酶用量为3%，酶解时间12 h，酶解温度35℃，溶胶温度80℃，该条件下明胶提取率为67.28%。