姜 曈， 李菁菁， 石 梅

空军军医大学附属第一医院 放射治疗科，陕西 西安 710032

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)在东南亚、中国南部流行，是一种高风险的头颈部肿瘤，具有高度的放射敏感性[1]。放射治疗(radiotherapy，RT)能有效控制早期NPC，且预后良好，对Ⅰ期及ⅡA期患者的5年总存活率分别为90%、84%[2]。然而，部分NPC患者在治疗后仍会出现局部复发、远处转移，而RT可能促进这些恶性进程。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)位于肿瘤异质性的顶端，除本身的致瘤潜能，其对包括RT在内的传统抗癌治疗方式具有抗性，可导致肿瘤的复发和转移。CSCs可自发地从正常和肿瘤性的非干细胞中产生，表明干细胞和非干细胞状态之间存在双向的相互转化[3]。有研究报道，电离辐射(ionizing radiation，IR)可促进肿瘤细胞转化生成类似干细胞生物学特征的表型，即CSCs表型[4-11]。本研究根据NPC的临床RT方式，模拟其分割疗法，建立IR后NPC残癌细胞株，通过检测NPC残癌细胞的成球能力及干细胞表型标志物表达，探讨辐射对NPC干细胞表型表达的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人NPC的CNE-1细胞购自中国科学院上海细胞库。1640培养基购自美国Hyclone；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青；磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)、RIPA裂解液(强)、Tween®20购自北京索莱宝；八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)引物、性别决定区Y框蛋白2 (SRY related HMG box-2,SOX2)引物、Kruppel样因子4(Kruppel-like factor 4,Klf4)引物、β-actin引物由北京奥科合成；总RNA提取试剂盒、FastKing cDNA第一链合成试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂购自北京天根；BCA蛋白定量试剂盒、蛋白预染marker购自美国Thermo；5倍Loading Buffer购自西安赫特；蛋白凝胶试剂盒购自武汉博士德；脱脂奶粉购自美国Difco；兔单克隆抗体OCT4、KLF4、SOX2购自美国Abcam；鼠单抗β-Actin购自美国CST；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG购自美国Pioneer；ECL化学发光液购自美国Milipore；人FGF生长因子、人EGF生长因子购自美国Peprotech；N2 Supplement、B27 Supplement购自美国Gibco；青霉素/链霉素混合液购自美国 Invitrogen。

1.2 仪器与耗材 CO2细胞培养箱、NanoDrop 2000购自美国Thermo；低温高速离心机购自德国Heraeus；台式常温离心机购自长沙湘仪；实时荧光定量聚合酶链式反应仪购自Bioneer；倒置光学显微镜购自日本Olympus；凝胶成像系统购自Bio-Rad；24孔超低吸附培养板购自美国Corning； 细胞培养板及培养瓶购自美国Eppendorf；PVDF膜购自美国Millipore。辐射源为60钴(60Co)，由空军军医大学辐照中心提供。

1.3 研究方法

1.3.1 细胞培养 在含10% FBS的1640培养液中进行细胞培养，细胞培养条件为5% CO2、37℃。

1.3.260Co γ射线照射 在25 cm2细胞培养瓶中接种已进入对数生长期的CNE-1细胞，待细胞生长融合至40%～50%瓶底面积时，模拟临床肿瘤RT的分割疗法，单次照射剂量为2 Gy，剂量率1 Gy/min，连续隔日照射。连续4次照射CNE-1细胞获得残癌细胞株E-R4；连续7次照射CNE-1细胞获得残癌细胞株E-R7。

1.3.3 实时定量聚合酶链式反应 使用总RNA提取试剂盒，按照天根DP419说明书进行总RNA提取。使用NanoDrop 2000在260 nm和280 nm处检测提取的RNA样品纯度及浓度。使用FastKing cDNA第一链合成试剂盒，按照天根KR116说明书进行反转录。使用SuperReal荧光定量预混试剂，按照天根FP205说明书进行实时定量聚合酶链式反应。引物序列如下：OCT4上游(5，-GTGGAGAGCAACTCCGATG-3，)，下游(5，-TGCTCCAGCTTCTCCTTCTC-3，)；KLF4上游(5，-CCGCTCCATTACCAAGAGCT-3，)，下游(5，-ATCGTCTTCCCCTCTTTGGC-3，)；SOX2上游(5，-CGAGTGGAAACTTTTGTCGGA-3，)，下游(5，-TGTGCAGCGCTCGCAG-3，)；β-actin上游(5，-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3，)，下游(5，-TCTTCATTGTGCTGGGTGCC-3，)。以β-actin snRNA作为实时定量聚合酶链式反应检测OCT4、KLF4和SOX2表达水平的内参，通过2-ΔΔCT法计算各组细胞间的表达差异。

1.3.4 成球实验 配置悬浮成球培养液(DMEM/F12培养液，1% N2，2% B27，1%双抗，20 ng/ml FGF，20 ng/ml EGF)。处于对数生长期的细胞胰酶消化后，离心5 min；吸弃上清，加入3 ml悬浮成球培养液，离心5 min(重复2遍)；吸弃上清，加入2 ml悬浮成球培养液后计数。用悬浮成球培养液进行等比稀释，2 000个/孔，1 ml/孔，种于超低附的24孔培养板。每组设置3个复孔。吸净超低附培养板中培养液和细胞，转移至15 ml离心管中。PBS清洗超低附培养板板孔，清洗后液体同样收集于离心管中(重复1遍)；离心5 min，重新加入悬浮成球培养液1 ml，吹打细胞沉淀10次，重新转移回原始超低附培养板板孔中，常规培养。每3 d更换1次悬浮成球培养液。超低附板培养10～15 d后，置于显微镜观察、拍摄并统计细胞成球的大小、数量。

1.3.5 免疫印迹 将细胞接种于25 m2培养瓶，待细胞融合至80%～90%时，吸弃培养液，用预冷PBS清洗细胞3次，培养皿、培养瓶置于冰上，加入强RIPA裂解液，冰上裂解30 min。细胞刮刷刮取并收集细胞，4℃ 12 000 g离心15 min，吸取部分上清，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，剩余上清加入1/4体积的5倍Loading Buffer，金属浴100℃加热5 min；配制10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，20 μg蛋白样本/泳道，恒压电泳，上层胶电压80 V，下层胶电压120 V；恒流转膜，电流200 mA湿转120 min；用含5%脱脂奶粉的TBST，室温封闭PVDF膜1 h，封闭后洗膜3次，每次5 min。TBST稀释一抗OCT4(1∶1 000)、KLF4(1∶1 000)、SOX2(1∶1 000)、β-Actin(1∶1 000)，孵育4℃过夜。次日清洗PVDF膜3次，5 min/次。TBST稀释二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG(1∶1 000)、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)，室温孵育2 h 。孵育后用TBST清洗PVDF膜3次，5 min/次。膜上滴加适量化学发光液，利用凝胶成像系统曝光成像。以β-Actin为内参，通过Image J软件计算条带的灰度值，比较细胞间OCT4、KLF4和SOX2表达水平差异。

2 结果

2.1 成球实验 成球实验结果显示，照射后，E-R4、E-R7的成球体积较亲本CNE-1细胞增大，见图1。照射后，E-R4、E-R7成球数量分别为(51.7±2.5)个、(69.7±0.6)个，明显高于亲本CNE-1细胞的(37.0±2.0)个，且E-R7成球数量高于E-R4，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图1 成球实验结果(100倍，a.亲本CNE-1细胞；b.E-R4；c.E-R7)

2.2 NPC细胞干细胞表型标志物表达情况比较 实时定量聚合酶链式反应结果显示，E-R4、E-R7细胞中SOX2、OCT4及KLF4的mRNA表达水平较亲本CNE-1细胞明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。免疫印迹结果显示，E-R4、E-R7细胞中SOX2、OCT4及KLF4的蛋白表达水平较亲本CNE-1细胞明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、图2。

表1 NPC细胞干细胞表型标志物mRNA相对表达量

注：与亲本CNE-1细胞比较，①P<0.05

3 讨论

RT是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，但有临床研究表明，亚致死剂量的IR反而促进癌症的恶性表型，导致治疗后复发[12-13]。虽然这一效应的机制尚未被完全解析，但反映出IR对具有辐射抗性的肿瘤细胞的选择性扩增，或在显露于亚致死剂量辐射后获得对辐射的耐药性。CSCs是肿瘤细胞的一个亚群，可在放疗后存活，并在治疗结束后重新开始增殖，导致复发和转移[14-15]。包括CSCs在内的恶性肿瘤细胞的基因表达谱显示，CSCs可能具有胚胎干细胞样的未成熟基因表达特征[16-18]。此外，CSCs还可通过改变自身代谢、调节微环境变化、逃避免疫监控、激活抗凋亡通路等方式适应RT引起的苛刻条件。

表2 NPC细胞干细胞表型标志物蛋白相对表达量

注：与亲本CNE-1细胞比较，①P<0.05

图2 NPC细胞干细胞表型标志物蛋白表达量

本研究根据NPC的临床RT方式，模拟其分割疗法，通过连续4次和7次60Co γ射线照射CNE-1细胞，获得CNE-1残癌细胞株。成球实验结果显示，照射后，E-R4、E-R7的成球体积较亲本CNE-1细胞增大，E-R4、E-R7成球数量明显高于亲本CNE-1细胞，且E-R7成球数量高于E-R4，提示连续多次照射可提高CNE-1细胞成球能力，且呈剂量依赖趋势。实时定量聚合酶链式反应与免疫印迹结果显示，E-R4、E-R7细胞中SOX2、OCT4及KLF4的表达水平较亲本CNE-1细胞明显提高，提示多次60Co γ射线照射可提高CNE-1细胞中干细胞表型标志物的表达。

SOX2、OCT4、KLF4共同形成多能调控网络，这些基本转录因子的相互作用完成了胚胎干细胞和诱导多能干细胞的多能状态[19-21]。SOX2在维持干细胞状态、谱系决定以及神经外胚层的发育中发挥重要作用[22-23]。Gen等[24]对食管鳞癌细胞系DNA的变化进行研究，并检测到SOX2基因的扩增。对于肺癌，SOX2促进细胞增殖，而SOX2敲除可逆转这些作用[25-26]。有研究发现，辐射抵抗的宫颈癌和化疗抵抗的口腔鳞癌患者OCT4表达水平升高[27-28]。过表达OCT4的黑色素瘤细胞生长更快，对缺氧和顺铂治疗耐受性更强[29-30]。有研究表明，KLF4在原发性乳腺导管癌及头颈部鳞状细胞癌中有高表达[31-33]。此外，KLF4的致癌作用是早期乳腺癌和皮肤癌的预后较差的因素之一[34-35]。本研究有助于阐明CSCs的生物学原理以及开发潜在的治疗干预手段，解除CSCs的防御机制，使其对辐射治疗引发的细胞死亡更敏感。此外，通过阻断维持信号直接抑制CSCs可减少耐辐射亚群。直接或间接使CSCs对辐射敏感的药物已在研究中，未来或有望加强临床RT的效果。

综上所述，2 Gy60Co γ射线连续照射可通过诱导SOX2、OCT4及KLF4提高鼻咽癌CNE-1细胞干细胞表型的表达。目前，RT的使用仍根据手术的类型和癌症的分期制定。为达到选择对RT有明显效果患者的目的，需更深入的研究IR反应的潜在预测因子，寻找可靠的IR反应预测方法。