林芳，陈静文，张志麒，刘呈雄，陈剑锋，邹坤，程凡，*

（1.三峡大学 生物与制药学院天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002；2.神农架国家公园管理局，湖北 神农架林区 442400）

睡眠，是高等脊椎动物周期出现的一种自发的和可逆的静息状态，对人类身体健康极为重要。随着社会生活节奏的加快，人们生活压力的增加使得越来越多的人出现睡眠问题。目前市面上的的镇静催眠药主要为巴比妥类和苯二氮卓类药物，但是该类西药治疗极易伴随有困倦乏力，头晕嗜睡等不良反应，长期服用可能出现成瘾性，突然停药会有戒断反应[1]。而传统安神中药镇静安神效果明显，副作用小的优点，目前市面上即可用作药品又可作为食品的安神类药材主要有酸枣仁，百合等。

睡菜（Menyanthes trifoliate L.）为龙胆科睡菜属多年生沼生草本，又名“醉草、绰菜、瞑菜”，以全草或叶入药，具有“食之令人思睡”的神奇功效。《北方常用中草药手册》曰：睡菜味甘微苦，性温，无毒，能健脾消食，养心安神[2-3]。民间部分地区有春夏季节采摘睡菜做泡菜的习惯，食用后使人思睡，睡菜也可作为啤酒的苦味剂，目前民间部分地区已将其作为安神类食物使用，但目前笔者尚未见对睡菜的镇静催眠活性和急性毒性活性的评价报道。

现有研究表明，睡菜所属的龙胆科植物中含有的化合物结构类型丰富多样，主要含有环烯醚萜类、黄酮类、三萜类、挥发油类以及其他类型的化合物[4-5]，根据不同的结构特征分布于不同的极性部位，在课题前期已经对睡菜总提取物镇静催眠活性进行了评价的基础上，为进一步验证其药理作用，为将睡菜作为安神保健类食物开发的后续研究提供理论依据，本课题初步对睡菜提取物灌胃小鼠急性毒性和镇静催眠活性部位进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验动物：昆明种小鼠（SPF 级），（20±2）g，雌雄各半，由三峡大学实验动物中心提供，实验单位使用许可证编号：SYXK（鄂）2017-0061；许可证号：SYXK（鄂）2017-0012，动物质量合格证编号NO.42010200001498；NO.42010200001499。分笼饲养，自由饮水和摄食，适应环境1 周后开始实验，控制室温为（22±2）℃，湿度为（55±15）%。

睡菜样品2016年8 月采集自湖北省神农架大九湖，经三峡大学生物与制药学院王玉兵博士鉴定为龙胆科睡菜属植物睡菜（Menyanthes trifoliate L.）的全草。干燥、粉碎后的睡菜全草经95%乙醇回流提取，浓缩后浸膏用水悬浮，分极性萃取得到石油醚部位、乙酸乙脂部位、正丁醇部位和水部位。

戊巴比妥钠盐（批号：F0749）：山东西亚化学工业有限公司；地西泮片（批号：H1020898）：北京益民药业有限公司。其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

YLS-1A 型多功能小鼠自主活动记录仪：上海欣软信息科技有限公司；Gzx-9240MBE 型数显鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；N-1001 型旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 睡菜提取物和萃取部位制备

睡菜样品40℃恒温干燥，经药物粉碎机粉碎后过筛，得到原药材粉末。加入4 L 的95%乙醇，常压回流提取3 次，每次2 h。提取液过滤后合并，50℃减压浓缩得到总浸膏，浸膏提取率约10%。总浸膏用水均匀混悬，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液减压浓缩，真空干燥后得到各部位提取物，各部位提取率约为25%。实验时使用质量分数为0.5%的羟甲基纤维素钠（sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na）溶液进行配置。

1.3.2 睡菜总提物小鼠急性毒性实验

1.3.2.1 小鼠急性毒性预实验

小鼠30只，雌雄各半，随机分组称重，每组6只，分为5组。设定剂量等比级数为1∶0.7，睡菜总提取物剂量分别为 2.4、3.43、4.9、7、10 g/kg。按不同剂量配制相应浓度的药液，最大给药浓度10 g/kg，各组给药体积均为0.4 mL/10 g，观察并记录小鼠的死亡情况。

1.3.2.2 小鼠急性毒性最大耐受量实验

经预实验，睡菜总提取物口服给与最大给药容积以及药物能溶解的最大给药剂量，仍未有小鼠死亡，因此进行睡菜总提取物小鼠急性毒性最大耐受量实验。

取小鼠32只，雌雄各半，随机分组称重，每组16只，分为两组即给药组和空白对照组。实验前禁食不禁水12 h，给药组单次灌胃给与最大给药浓度10 g/kg，最大灌胃体积0.4 mL/10 g；空白对照组给与相应体积的0.5%的CMC-Na 溶液。给予药物后每天至少观察记录2 次小鼠状态，观察指标包括有小鼠外观体征、行为活动、呼吸、粪便性状等。观察期间保证小鼠喂养条件不变，发现死亡小鼠记录死亡时间并及时进行解剖，连续1 周每天定时对小鼠进行观察并记录小鼠体重。1 周后将所有小鼠处死解剖[6-8]。

1.3.3 小鼠自主活动影响实验

根据《中华本草》记载的睡菜用药：睡菜，内服：煎汤，10 g～15 g[9]。参考《药理实验方法学》，人和小鼠按体表面积折算的等效剂量比值为0.002 6[10]。实验过程中，依据人的剂量为15 g，换算成小鼠剂量，睡菜小鼠给药的生药量为 1.95 g/kg（15 g/kg×0.002 6/0.02 kg），浸膏提取率10%，即总浸膏给药量为0.195 g/kg，各部位萃取率均约为25%，即部位给药低剂量为临床剂量50 mg/kg，部位给药高剂量组设为临床剂量的4 倍，200 mg/kg。

小鼠100只，每组10只，随机分为10组，即空白组、阳性药组（地西泮0.25 mg/kg）、石油醚部位组（50、200 mg/kg）、乙酸乙酯部位组（50、200 mg/kg）、正丁醇部位组（50、200 mg/kg）、水部位组（50、200 mg/kg）。按体重连续灌胃给药7 d，空白组灌胃相应体积的0.5%CMC-Na，末次灌胃给药前，禁食不禁水12 h，末次灌胃给药60 min 后，将各组小鼠置于自主活动仪中，适应5 min 后，开始测定各组小鼠的自主活动情况，记录10 min 内小鼠的自主活动次数。

1.3.4 协同阈下剂量戊巴比妥钠小鼠入睡率实验

戊巴比妥钠剂量预实验，取30只小鼠，随机分为5组，每组6只，分别腹腔注射戊巴比妥钠，剂量为20、25、30、40、45 mg/kg。记录 30 min 内小鼠的入睡率，保持90%动物不睡的最大剂量即为阈下剂量，而阈上剂量为保持所有动物全部入睡的最小剂量。

实验分组如同小鼠自主活动实验分组，按体重连续灌胃给药7 d，空白组灌胃相应体积的0.5%CMCNa，末次灌胃给药前，禁食不禁水12 h。根据戊巴比妥钠剂量预实验，选定腹腔注射戊巴比妥钠溶液阈下剂量为25 mg/kg，可保持90%小鼠不睡，末次灌胃给药60 min 后，腹腔注射戊巴比妥钠溶液阈下剂量25 mg/kg，观察小鼠，60 s 翻正反射消失为发生睡眠，记录30 min内翻正反射消失的动物只数，计算睡眠百分率。

睡眠百分率/%=入睡动物只数/动物总只数×100

1.3.5 协同阈上剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间实验

实验分组如同小鼠自主活动实验分组，按体重连续灌胃给药7 d，末次灌胃给药前，禁食不禁水12 h，空白组灌胃相应体积的0.5%CMC-Na。根据戊巴比妥钠剂量预实验，当戊巴比妥钠剂量为40 mg/kg 时，小鼠并未全部入睡，剂量为45 mg/kg 时小鼠全部入睡，因此选定腹腔注射戊巴比妥钠溶液阈上剂量为45 mg/kg，末次灌胃给药60 min 后，腹腔注射戊巴比妥钠溶液阈上剂量45 mg/kg，观察小鼠，记录小鼠注射后到翻正反射消失的时间为入睡潜伏期，翻正反射消失到翻正反射恢复的时间为小鼠睡眠时间[11-14]。

1.3.6 统计方法

采用统计学软件SPSS 25.0 软件对实验数据分析处理。不同剂量组灌胃给药后，引起的给药组和对照组之间的差异显著性采用单因素方差分析法进行多重比较，阈下剂量戊巴比妥钠实验数据采用Fisher 精确检验分析。数据以表示，以P〈0.05 为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 睡菜提取物小鼠急性毒性

最大耐受量法评价睡菜提取物小鼠急性毒性，一般行为学观察，与空白对照组相比，给药当天给药组出现部分小鼠自主活动减少，部分小鼠出现昏睡，但是易警醒而恢复正常活动。1 h 后小鼠自主活动逐步恢复正常。睡菜提取物对小鼠体重的影响结果见表1所示。

表1 睡菜提取物对小鼠体重的影响（，n=16）Table 1 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on weight gain in mice（，n=16）

表1 睡菜提取物对小鼠体重的影响（，n=16）Table 1 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on weight gain in mice（，n=16）

注：-表示灌胃同体积CMC-Na 溶液。

分组 剂量/（g/kg）给药前/g给药当天/g给药次日/g 1 周后/g空白组 - 19.7±0.8 22.0±0.9 22.5±1.2 30.4±1.7睡菜提取物组 10 18.9±0.9 21.7±1.2 21.4±1.6 28.8±2.9

由表1可知，与空白对照组相比，给药当日小鼠进食量略微减少，体重降低，但毛色光滑，粪便，尿液，活动未见明显异常；第2 天小鼠活动，摄食，体重增长基本恢复正常，且1 周内无动物死亡。1 周后动物体重均有增加，两组动物体重差异并不明显。观察期结束后对所有小鼠进行解剖，肉眼观察给药组动物的主要脏器，与空白对照组相比无明显差异。

2.2 睡菜提取物对小鼠自主活动的影响

睡菜提取物对小鼠自主活动的影响结果如表2所示。

表2 睡菜提取物对小鼠自主活动的影响（，n=10）Table 2 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the autonomic activity（，n=10）

表2 睡菜提取物对小鼠自主活动的影响（，n=10）Table 2 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the autonomic activity（，n=10）

注：与空白组相比，*P〈0.05 有显著差异。-表示灌胃同体积CMC-Na溶液。

组别剂量/（mg/kg）自主活动次数空白对照组 - 128.5±9.14地西泮组 0.25 72.2±9.46*石油醚高剂量组 200 128.1±9.81石油醚低剂量组 50 127.2±8.92乙酸乙酯高剂量组 200 76.7±7.96*乙酸乙酯低剂量组 50 85.6±9.12*正丁醇高剂量组 200 72.2±12.92*正丁醇低剂量组 50 78.1±7.43*水部位高剂量组 200 136±9.07水部位低剂量组 50 131.8±11.71

由表2可知，与空白对照组相比，睡菜提取物乙酸乙酯部位以及睡菜提取物正丁醇部位组的小鼠自主活动次数明显减少，且具有统计学差异。而睡菜提取物石油醚部位以及睡菜提取物水部位组小鼠自主活动次数与空白对照组相比无明显差异。

2.3 睡菜提取物对阈下剂量小鼠戊巴比妥钠镇静催眠作用的影响

睡菜提取物对阈下剂量小鼠戊巴比妥钠镇静催眠作用的影响结果如表3所示。

表3 睡菜提取物对小鼠入睡率（戊巴比妥钠阈下剂量）的影响（n=10）Table 3 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the sleep rate in mice（n=10）

由表3可知，睡菜石油醚部位入睡率与空白组无明显差异。睡菜提取物可增加阈下剂量戊巴比妥钠小鼠入睡率，且睡菜提取物的乙酸乙脂部位，正丁醇部位以及水部位均能一定程度上增加阈下剂量戊巴比妥钠的小鼠入睡率。阳性药物组入睡率为60%，乙酸乙酯高剂量组入睡率为60%，而正丁醇部位低剂量组入睡率为70%。乙酸乙酯部位和正丁醇部位戊巴比妥钠阈下剂量镇静催眠作用明显。

2.4 睡菜提取物对阈上剂量小鼠戊巴比妥钠镇静催眠作用的影响

睡菜提取物对阈上剂量小鼠戊巴比妥钠镇静催眠作用的影响结果如表4所示。

表4 睡菜提取物对小鼠睡眠潜伏期和入睡率（戊巴比妥钠阈上剂量）的影响（，n=10）Table 4 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the latency of sleep and the sleep time of mice（，n=10）

表4 睡菜提取物对小鼠睡眠潜伏期和入睡率（戊巴比妥钠阈上剂量）的影响（，n=10）Table 4 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the latency of sleep and the sleep time of mice（，n=10）

注：与空白组相比，*P〈0.05 有显著差异。-表示灌胃同体积CMC-Na溶液。阈上剂量戊巴比妥钠实验数据采用Fisher 精确检验分析。

组别剂量/（mg/kg） 睡眠潜伏期/min 睡眠时间/min空白对照组 - 6.97±0.22 33.54±0.14地西泮组 0.25 4.01±0.18* 50.61±0.18*石油醚高剂量组 200 6.02±0.25 31.35±0.18石油醚低剂量组 50 6.01±0.26 32.78±1.39乙酸乙酯高剂量组 200 5.01±0.44 47.29±1.60*乙酸乙酯低剂量组 50 5.03±0.25 52.10±1.46*正丁醇高剂量组 200 3.3±0.31* 64.34±1.42*正丁醇低剂量组 50 4.05±0.18* 52.10±1.46*水部位高剂量组 200 6.06±0.24 37.32±0.95水部位低剂量组 50 5.95±0.18 36.08±1.01

由表4可知，与空白组相比，睡菜提取物石油醚部位、水部位的睡眠潜伏期和睡眠时间均无明显差异；而正丁醇部位高剂量组，正丁醇部位低剂量组，乙酸乙脂部位高剂量组，乙酸乙脂部位低剂量组可明显缩短戊巴比妥钠阈上剂量小鼠睡眠潜伏期，延长睡眠时间。阳性药物组深度睡眠时间（50.61±0.18）min，乙酸乙酯部位低剂量组深度睡眠时间（52.10±1.46）min，正丁醇部位高低剂量组深度睡眠时间分别为（52.10±1.46）min 和（64.34±1.42）min。结果显示，乙酸乙酯部位和正丁醇部位戊巴比妥钠阈上剂量镇静催眠活性明显。

3 结论与讨论

相关文献古籍对睡菜毒性及其安神功效早已有记载[2-4]，但至今，对其毒理和药理活性研究甚少。为明确睡菜的安全性和药效，也为后续将睡菜作为安神保健食物正式开发利用，本课题对睡菜提取物的小鼠经口给药急性毒性及其镇静催眠活性进行了研究。

实验结果表明，睡菜提取物急性毒性的MTD 大于10 g/kg，证实睡菜提取物灌胃给药的小鼠急性毒性较低，初步从现代医学角度对睡菜的食用安全性进行了佐证。以地西泮作为阳性对照，行为学评价睡菜提取物镇静催眠活性，镇静催眠活性实验结果显示，睡菜提取物具有较好的镇静催眠活性，通过对活性部位的追踪，初步确定其镇静催眠活性部位为乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

对龙胆科植物化学成分研究发现，龙胆科植物乙酸乙酯部位的主要化合物类型为三萜类化合物[15]和黄酮类化合物，而正丁醇部位主要为环烯醚萜苷类化合物以及黄酮苷类化合物[16]。现有研究对这几种化合物镇静催眠活性研究均有报道，如酸枣仁中的镇静催眠活性成分斯皮诺素[17]，合欢花中的主要镇静催眠活性成分槲皮素，槲皮苷等[18-19]，以及龙胆科植物中的獐牙菜苦苷都有中枢神经镇静作用[20]。现有文献报道与实验研究结果相互佐证，睡菜乙酸乙酯部位和正丁醇部位的镇静催眠活性可能与这些类型化合物相关。

本课题为睡菜的食用安全性和药理活性提供了一定的科学依据，也从现代医学角度佐证了睡菜的功效及其在古代的应用，深化了中医药理论。睡菜具有毒性小且镇静催眠效果明显的特点，本课题初步探究明确镇静催眠活性部位，在后续的研究中，将根据活性导向，进一步探索睡菜镇静催眠活性的药效物质基础，为将睡菜正式开发为安神保健食品打下基础。