单敏敏 李长安 崔红生

[摘要] 目的 觀察中药复方哮喘宁颗粒对Th1/Th2平衡和STAT1通路的影响，探讨其抗哮喘的作用机制。 方法 SPF级雄性SD大鼠40只，采用数字随机法将其随机分成5组，正常组、哮喘组、IL-27预防组、哮喘宁颗粒组和哮喘宁颗粒+Fludarabine（STAT1抑制剂）组，每组8只，采用卵白蛋白联合氢氧化铝腹腔注射致敏和卵白蛋白滴鼻激发的方法建立哮喘模型大鼠。各组分别于致敏前阶段采用IL-27滴鼻预防（IL-27预防组），或激发阶段灌胃哮喘宁颗粒进行治疗（哮喘宁颗粒组），或合并腹腔注射STAT1抑制剂Fludarabine观察效果。各组均于最后一次激发后处死大鼠，收集血清和支气管肺泡灌洗液（BALF），ELISA检测白细胞介素4（IL-4）和γ干扰素（IFN-γ）表达含量，Western blot检测肺组织pSTAT1（STAT1磷酸化蛋白）、信号转导与转录激活因子1（STAT1）蛋白表达水平。结果 与哮喘组模型大鼠比较，哮喘宁颗粒组和IL-27预防组大鼠血清和BALF中IL-4含量明显降低，IFN-γ含量明显上升（P < 0.05），与哮喘宁颗粒组大鼠比较，Fludarabine抑制了哮喘宁颗粒的治疗作用（P < 0.05）。与哮喘组模型大鼠比较，哮喘宁颗粒组和IL-27预防组大鼠肺组织中pSTAT1的蛋白表达水平明显升高（P < 0.05），与哮喘宁颗粒组大鼠比较，Fludarabine抑制pSTAT1蛋白的表达（P < 0.05）。 结论 哮喘宁颗粒能有效改善哮喘大鼠体内的Th1/Th2失衡，并上调受抑制的pSTAT1蛋白水平，增加STAT1通路的磷酸化，其治疗哮喘的机制可能通过与IL-27诱导的STAT1磷酸化通路相关。

[关键词] IL-27通路；哮喘宁颗粒；支气管哮喘；Th1/Th2；STAT1磷酸化

[中图分类号] R256 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（a）-0011-05

Protective effect of Xiaochuangning Granules on Th1/Th2 balance and STAT1 phosphorylation in asthma rats

SHAN Minmin1 LI Changan2 CUI Hongsheng3

1.Beijing University of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2.Department of Pulmonary Disease，Dongzhimen Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 3.Department of Pneumology， the Third Affiliated Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100029， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Xiaochuangning Granules on Th1/Th2 balance and STAT1 pathway in asthma， and to explore its anti-Xiaochuangning mechanism. Methods Fourty SPF male SD rats in total， using the digital random method randomly divided into 5 groups， the normal group， asthma group， IL-27 prevention， Xiaochuangning Granules group and the asthma rather pellet + Fludarabine （STAT1 inhibitors） group， each group of eight rats， were established by intraperitoneal injection of ovalbumin joint aluminum hydroxide sensitization and intranasal ovalbumin excitation method were established. Each group was treated with IL-27 nasal drops （IL-27 prevention group） in the pre-sensitization stage， or by gavage of Xiaochuangning Granules （Xiaochuangning Granules group） in the excitation stage， or combined with intraperitoneal injection of the STAT1 inhibitor Fludarabine to observe the effect. Rats in each group were sacrificed after the last stimulation， serum and BALF were collected， the expression levels of IL-4 and IFN-γ were detected by ELISA， and the expression levels of pSTAT1 （STAT1 phosphorylated protein）， signal transduction and transcriptional activator 1 （STAT1） in lung tissues were detected by Western blot. Results Compared with the model rats in asthma group， the IL-4 contents in serum and BALF were significantly decreased and the IFN-γ contents were significantly increased in Xiaochuangning Granules group and IL-27 prevention group （P < 0.05）. Compared with Xiaochuangning Granules group， Fludarabine inhibited the therapeutic effect of Xiaochuangning Granules （P < 0.05）. Compared with the asthma group model rats， the expression level of pSTAT1 protein in the lung tissues of the Xiaochuangning Granules group and the IL-27 prevention group was significantly increased （P < 0.05）， and Fludarabine inhibited the expression of pSTAT1 protein in the lung tissues of the Xiaochuangning Granules group （P < 0.05）. Conclusion Xiaochuangning Granules can effectively improve Th1/Th2 imbalance in Xiaochuangning rats， and up-regulate the level of inhibited pSTAT1 protein and increase the phosphorylation of the STAT1 pathway. The mechanism of asthma treatment may be related to the IL-27 induced phosphorylation of the STAT1 pathway.

[Key words] Interleukin-27 pathway； Xiaochuangning Granules； Bronchial asthma； Th1/Th2； STAT1 phosphorylation

支气管哮喘（简称哮喘）患病率逐年上升，全世界至少有3亿患者，我国至少有3000万患者[1]。在我國的一项“全国支气管哮喘患病情况及相关危险因素流行病学调查”（China Asthma and Risk Factors Epidemiologic Investigation，CARE研究）发现，我国的哮喘患病率达到1.24%[2]。哮喘宁颗粒是武维屏教授基于调肝理肺思路研制的治疗支气管哮喘的经验方，该方临床应用30余年，效果显著，本课题组既往临床研究[3]表明，哮喘宁颗粒治疗支气管哮喘的控显率和总有效率分别达到63.33%和90.00%。从病理机制分析，哮喘是一种免疫性疾病，Th（T helper lymphocyte cells，辅助性T淋巴细胞）亚群Th1/Th2的细胞失衡是哮喘免疫学发病的基础[4]，基于白细胞介素-27（IL-27）通路对Th细胞免疫平衡的调节作用，提出“哮喘宁颗粒通过调控IL-27通路从而达到调节哮喘Th1/Th2免疫失衡，减轻气道炎性反应”的科学假说。本项目建立在既往研究工作基础上，通过哮喘宁颗粒干预哮喘模型大鼠，与其余各组比较，采用支气管肺泡灌洗、ELISA、WB等技术与方法，分别对该模型的支气管肺组织、支气管肺泡灌洗液等进行深入研究，揭示哮喘宁颗粒在IL-27通路调控中的作用靶点，阐明哮喘宁颗粒通过IL-27通路调节支气管哮喘Th1/Th2免疫平衡的作用机制，为其临床应用提供客观实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠40只，3～4周龄，雄性，体重（120±10）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供[许可证编号SCXK（京）2016-0011]，常规饲养于北京中医药大学SPF级动物房，12 h光照和夜循环，温度（22±2）℃，湿度（55±5）%。

1.2 主要试剂

哮喘宁颗粒（北京中医药大学东直门医院制剂室生产，12 g/袋，批准文号：京药制字Z20053078，产品批号：1807060）。卵蛋白（OVA，V级，批号：RH42844）购自美国Sigma公司。氢氧化铝佐剂（厂家Adjuvants-Alum，Pierce，生产批号：77161）；重组人IL-27（Proteintech公司，生产批号：HZ-1275）；特异性STAT1抑制剂（Fludarabine，Bioruler，生产批号：RJ1179）；β-atin单克隆抗体（Cell Signaling，生产批号：4970S）；γ干扰素（IFN-γ）ELISA试剂盒（liuhe biotech公司，生产批号：LH-E10096RA）；IL-4 ELISA试剂盒（liuhe biotech公司，生产批号：LH-E10102RA）；IFN-γ抗体（Affinity公司，生产批号：DF6045）；PSTAT1（Affinity公司，生产批号：AF3449）；STAT1抗体（Proteintech公司，生产批号：10144-2-AP）；IL-4抗体（Proteintech公司，生产批号：66142-1-IG-150）均购自北京百诺威生物科技有限公司。eECL Western Blot Kit高灵敏度化学发光检测试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，生产批号：CW0049）；PVDF 膜购自Millipore公司。

1.3 实验分组及治疗方案

大鼠经适应性喂养1周后，采用随机数字法将其分为5组，每组8只，分别为正常组、哮喘组、IL-27预防组、哮喘宁颗粒组和哮喘宁颗粒+Fludarabine组，参照文献[5]建立大鼠哮喘模型。

1.3.1 哮喘组 于实验第l、7天向大鼠腹腔注射含OVA（100 mg）、氢氧化铝（100 mg）的混合液1 mL致敏，第15天每天1% OVA滴鼻激发，每天1次，连续7 d，末次激发后次日处死大鼠。

1.3.2 IL-27预防组 于实验前7 d至实验第7天，在大鼠麻醉状态下（异氟烷吸入性麻醉），鼻腔滴入IL-27溶液，每日2次，每次200 ng；其余操作同哮喘组。

1.3.3 哮喘宁颗粒组 实验第15天开始，每天激发前2 h给予哮喘宁颗粒2.18 g/kg 灌胃，每日1次，连续7 d；其余操作同哮喘组。

1.3.4 哮喘宁颗粒+Fludarabine组 实验第15天开始给予哮喘宁颗粒时，同时腹腔注射80 mg/kg Fludarabine[溶解于无菌磷酸盐冲溶液（PBS）中]，每日1次，连续7 d；其余操作同哮喘宁组。

1.3.5 正常组 致敏和激发均以0.9%生理盐水，流程同哮喘组。

1.4 实验方法

于实验第21天末次激发后次日，将大鼠用水合氯醛腹腔麻醉处死后，按照下述方法进行取材：

1.4.1 血清取材 各组大鼠剖腹后，分离腹主动脉取血，经37℃水浴15 min至凝，1500 r/min离心10 min，离心半径8 cm，分离血清，-80℃冰箱保存。

1.4.2支气管肺泡灌洗液（BALF）取材 分离取出完整的气管、支气管和肺组织，结扎左侧主支气管，于右肺进行气管插管肺泡灌洗，每次注入2 mL生理盐水，抽吸3次后收集液体；重复3次；经1500 r/min离心10 min，离心半径13.5 cm，上清液于-80℃冰箱保存。

1.4.3肺组织取材 分别取右侧支气管肺组织，称重，按照质量/体积比例为10，加入裂解液，真空匀浆裂解后，经3000 r/min低温离心10 min，上清液于-80℃冰箱保存。

1.5 ELISA 检测IL-4和IFN-γ表达水平

根据厂家说明书，严格按照实验流程检测血清和BALF中IL-4和IFN-γ的表达水平。

1.6 Western blot检测pSTAT1和STAT1蛋白水平

蛋白上清液用考马斯亮蓝方法检测总蛋白含量，加入SDS loading buffer煮沸5 min，取50 mg蛋白上样，10%SDS PAGE分離总蛋白并电转移至硝酸纤维素膜（PVDF）上；用脱脂奶粉封闭PVDF膜后，用1∶1000稀释倍数的pSTAT1、STAT1和GAPDH抗体（均用TBST稀释）杂交，TBST反复清洗3次后，用1∶5000稀释倍数的羊抗IgG杂交，TBST反复清洗3次后，超敏ECL化学发光显像，凝胶图像分析系统扫描各蛋白条带的灰度值，以GAPDH作为内参蛋白。

1.7 统计学方法

采用SPSS16.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，各组数据采用One-way ANOVA分析，进一步组间两两比较采用Tukey法进行，以P < 0.05作为差异统计学有意义。

2 结果

2.1 五组血清和BALF中IFN-γ及IL-4水平的比较

末次激发后次日，与正常组大鼠比较，哮喘组大鼠血清和BALF的IL-4水平显著增加（P < 0.01），IFN-γ水平显著降低（P < 0.01），证明复制出哮喘大鼠模型，出现Th1/Th2失衡。与哮喘组大鼠比较，IL-27预防组和哮喘宁颗粒组大鼠血清和BALF的IL-4水平均显著下降（P < 0.01），而IFN-γ水平明显升高（P < 0.05）。但当同时给予Fludarabine处理时，可见Th1/Th2失衡的改善效果不足，甚至血清和BALF中的IFN-γ水平同哮喘模型大鼠比较，差异无统计学意义（P > 0.05），且与哮喘宁组大鼠比较，哮喘宁颗粒+Fludarabine组大鼠的IL-4和IFN-γ水平分别有明显的上调和下降（P < 0.05），证实Fludarabine阻碍哮喘宁颗粒的治疗效果。见表1。

2.2 五组肺组织pSTAT1和STAT1蛋白水平变化

各组大鼠肺组织内的STAT1蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与正常组比较，哮喘模型组大鼠pSTAT1蛋白水平明显减少（P < 0.01）；与哮喘组比较，IL-27预防组和哮喘宁颗粒组，pSTAT1水平明显提高（P < 0.05），且哮喘宁颗粒组治疗效果优于IL-27预防组（P < 0.05）；与哮喘宁颗粒组比较，哮喘宁颗粒+Fludarabine组pSTAT1表达水平明显降低（P < 0.01）。这一结果提示哮喘宁颗粒的治疗作用与STAT1通路相关。见图1。

3 讨论

支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，以气道高反应性和可逆性气流受限为主要特征[6]。其病因繁多，发病机制复杂，而“卫生假说”（Hygiene Hypothesis）是被广泛认可的哮喘发病原因，基于该假说的免疫学机制，认为Th1/Th2失衡及Th2免疫优势是促使哮喘发病的重要基础[7]。目前已有大量的报道[8-9]证实，通过诱导Th1反应，刺激IL-12、IFN-γ生成，抑制Th2相关细胞因子的分泌，使Th1/Th2恢复正常，可以抑制哮喘的发生。Th1和Th2两种细胞通过分泌多种抗炎或促炎的细胞因子，在体内发挥重要的作用，也通过分泌这些细胞因子，二者得以相互抑制。IFN-γ主要由Th1细胞分泌，既具有促炎作用，也具有免疫负向调节功能[10]。在Th1/Th2平衡中，IFN-γ结合并活化其受体，激活下游JAK-STAT通路，进一步上调T-box transcription factor（T-bet）而促进Th1细胞分化。IL-4主要由Th2细胞分泌，单独采用IL-4孵育Th0细胞，既可以维持Th2细胞的增殖，也可以抑制Th1细胞分化[11]；IL-4是诱导T细胞炎性反应的早期启动因素，通过增强黏附类、趋化类蛋白的表达，诱导呼吸道内炎症细胞的聚集、活化，加重支气管哮喘急性发作的次数和症状[12]。IFN-γ和IL-4在哮喘的发病过程中起着重要作用，并与哮喘的严重程度相关[11]。在本研究中，可见哮喘宁颗粒明显上调血清和BALF中的IFN-γ水平，降低IL-4水平，提示哮喘宁颗粒具有改善Th1/Th2失衡的作用。

本研究结果显示，IL-27可能在哮喘的病理生理机制中扮演着重要角色[13]。IL-27为新发现的IL-12家族的细胞因子[14]，能够促进Th1型细胞免疫应答，抑制Th2细胞应答[15]。本研究发现在大鼠哮喘模型中，IL-27预防组血清和BALF中的IL-4水平明显降低，证实大鼠哮喘模型体内的Th2水平受到抑制。这一结果同Su等[16]的研究结果相似，Su发现IL-27提前给药可以抑制哮喘小鼠BALF中的IL-5和IL-13水平，推测抑制小鼠哮喘模型体内的Th2水平。同IL-27预防组表现相似的是，哮喘宁颗粒也可以明显抑制哮喘大鼠体内的IL-4和Th2水平。鉴于比较哮喘宁颗粒同IL-27预防对Th1/Th2平衡的目的，本研究在验证IL-27预防对Th2水平代表因子IL-4影响的基础上，还检测IL-27预防对Th1水平特征性因子IFN-γ的影响，发现哮喘宁颗粒同IL-27预防均可以增强哮喘大鼠体内的IFN-γ和Th1水平。根据以上结果，推测哮喘宁颗粒抑制哮喘发作的机制可能同IL-27调控通路相关。

研究[17-18]发现，IL-27可以诱导Th细胞向Th1方向分化并分泌IFN-γ。Th细胞表面分布的IL-27受体与IL-27结合后，激活STAT1通路，由受体上的pg130亚基招募JAK1或JAK2，JAK发生自身磷酸化后再进一步磷酸化和二聚化STATs分子，而二聚化的pSTATs转位进入细胞核中，结合于特定的靶基因序列，发挥转录因子的作用。Villegas-Mendez等[19]研究发现，IL-27能够上调小鼠Th细胞转录因子T-bet表达水平，进而促进Th1细胞分化和分泌IFN-γ；IL-27和JAK-STATs通路除了可以促进Th1的细胞分化，也可通过上调IL-12Rβ2的表达间接抑制Th2细胞的特异性转录因子GATA-3表达，但是，阻断STAT1磷酸化水平可以减弱IL-27抑制Th2的作用，证明IL-27通过STAT1磷酸化抑制Th2细胞分化[20]。STAT1磷酸化对于IL-27生物学功能的正常发挥极为重要[21]，Chen等[22]发现，血清IL-4水平高的哮喘患者存在IL-27治疗耐受的现象，IL-27无法抑制Th2细胞分化，随后发现这一现象可能与IL-4诱导Th细胞抑制STAT1磷酸化相关。研究[4，24]表明，支气管哮喘气道中 STAT1 磷酸化障碍，引起IL-27抑制Th2细胞功能受损，导致Th1/Th2平衡失调，诱发、加重哮喘。因此，提高STAT1磷酸化水平，增强IL-27通路对Th2细胞的抑制作用，恢复哮喘患者气道内Th1/Th2免疫平衡，给哮喘治疗提供了新的通路及靶点。

在本研究中，哮喘寧颗粒可有效改善Th1/Th2平衡，但加入STAT1抑制剂后，这一改善作用失效，提示STAT1磷酸化对哮喘宁颗粒调节Th1/Th2平衡起重要的作用。根据肺组织中STAT1磷酸化水平的比较，进一步证实哮喘宁颗粒同IL-27预防给药均可以上调pSTAT1水平，增加STAT1通路的磷酸化，但加入STAT1抑制剂Fludarabine后，阻碍了哮喘宁颗粒逆转pSTAT1水平下调的作用，证实哮喘宁颗粒的治疗作用与STAT1通路的磷酸化相关。

根据以上结果，本研究认为哮喘宁颗粒抑制哮喘发作的机制是通过IL-27介导的STAT1通路改善Th1/Th2失衡而实现的。然而，STAT1通路还有哪些信号分子参与，仍需要深入的研究。

[参考文献]

[1] 沈华浩，杜旭菲，应颂敏.新版中国支气管哮喘防治指南与全球支气管哮喘防治创议的异同[J].中华结核和呼吸杂志，2018，41（3）：166-168.

[2] 苏楠，林江涛，刘国梁，等.我国8省市支气管哮喘患者控制水平的流行病学调查[J].中华内科杂志，2014，53（8）：601-606.

[3] 崔红生，武维屏，赵燕荣，等.哮喘宁煎剂治疗支气管哮喘急性发作期的临床研究[J].北京中医药大学学报，1999（1）：57-60.

[4] Hu C，Li Z，Feng J，et al. Glucocorticoids Modulate Th1 and Th2 Responses in Xiaochuangning Mouse Models by Inhibition of Notch1 Signaling [J]. Int Arch Allergy Immunol，2018，175（1/2）：44-52.

[5] 任传云，武维屏，周冠芬，等.哮喘宁颗粒剂对哮喘大鼠糖皮质激素受体的影响[J].中国中医药信息杂志，2004， 11（2）：118-119.

[6] 中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南（2016年版）[J].中华结核和呼吸杂志，2016，39（9）：675-697.

[7] 谢华健，周小敏，林奇栋，等.哮喘患者血清Th1/Th2类细胞因子水平变化及意义[J].山东医药，2011，51（31）：59-60.

[8] Loureno O，Mafalda Fonseca A，Taborda-Barata L. T cells in sputum of Xiaochuangning patients are activated independently of disease severity or control [J]. Allergol Immunopathol，2009，37（6）：285-292.

[9] Nakanishi K，Tsutsui H，Yoshimoto T. Importance of IL/-18-induced super Th1 cells for the development of allergic inflammation [J]. Allergol Int，2010，59（2）：137-141.

[10] 张红，顾猛.过敏性哮喘患儿血浆IFN-γ与IL-4及粪便双歧杆菌检测及分析[J].国际检验医学杂志，2015， 36（3）：367-368.

[11] Tsuchiya K，Isogai S，Tamaoka M，et al. Depletion of CD8+ T cells enhances airway remodelling in a rodent model of asthma [J]. Immunology，2009，126（1）：45-54. doi：10.1111/j.1365-2567.2008.02876.x.

[12] Matsukura S，Odaka M，Kurokawa M，et al. Transforming growth factor-β stimulates the expression of eotaxin/CC chemokine ligand 11 and its promoter activity through binding site for nuclear factor-κβ in airway smooth muscle cells [J]. Clin Exp Allergy，2010，40（5）：763-771. doi：10.1111/j.1365-2222.2010.03474.x.

[13] 何燕超，揭志军.白细胞介素27对哮喘免疫调控及治疗的研究进展[J].医学综述，2015，21（23）：4230-4233.

[14] Pflanz S，Timans JC，Cheung J，et al. IL-27，a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein，induces proliferation of naive CD4+ T cells [J]. Immunity，2002，16（6）：779-790.

[15] Artis D，Villarino A，Silverman M，et al. The IL-27 receptor （WSX-1） is an inhibitor of innate and adaptive elements of type 2 immunity [J]. J Immunol，2004，173（9）：5626-5634.

[16] Su X，Pan J，Bai F，et al. IL-27 attenuates airway inflammation in a mouse asthma model via the STAT1 and GADD45γ/p38 MAPK pathways [J]. J Transl Med，2016， 29，14（1）：283.

[17] 万晓朋，熊伟，张梅，等.IL-27对哮喘小鼠血清IgE的影响[J].成都医学院学报，2013，8（1）：23-25.

[18] Cao Y，Doodes PD，Glant TT，et al. IL-27 induces a Th1 immune response and susceptibility to experimental arthritis [J]. J Immunol，2008，180（2）：922-930.

[19] Villegas-Mendez A，de Souza JB，Lavelle SW，et al. IL-27 receptor signalling restricts the formation of pathogenic，terminally differentiated Th1 cells during malaria infection by repressing IL-12 dependent signals [J]. PLoS Pathog，2013，9（4）：e1 003 293. doi：10.1371/journal.ppat. 1003293.

[20] Lucas S，Ghilardi N，Li J，et al. IL-27 regulates IL-12 responsiveness of naive CD4+ T cells through Stat1-dependent and -independent mechanisms [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100（25）：15047-15052.

[21] 赵云峰，梁栋，张梅，等.IL-27对哮喘小鼠气道炎症的影响[J].中国医药生物技术，2010，10（5）：357-360.

[22] Chen Z，Wang S，Erekosima N，et al. IL-4 confers resistance to IL-27-mediated suppression on CD4+ T cells by impairing STAT1 signaling [J]. J Allergy & Clinical Immunol，2013，132（4）：912-921.

[23] 黄伟強，李惠，袁梅，等.支气管哮喘患者外周血T细胞亚群Th1、Th2及其相关细胞因子水平变化及意义[J].山东医药，2015（20）：40-41.

（收稿日期：2018-01-07 本文编辑：封 华）