吴伟东 姜锋

[摘要] 目的 評估基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）鉴别诊断良恶性胸腔积液的准确性。 方法 方便选取广州市红十字会医院心胸外科2017年2月—2018年2月收治的符合标准的126例患者为研究对象。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测63例恶性胸腔积液（恶性组）和63例良性胸腔积液（良性组）中的MMP-9、TIMP-1、乳酸脱氢酶（LDH）和糖类抗原15-3（CA15-3）。并通过底物酶谱法检测MMP-9的活性。 结果 恶性组MMP-9水平（1 578.36±133.27）pg/mL明显高于良性组（528.35±127.21）pg/mL； TIMP-1水平（1 057.46±140.89）pg/mL也高于良性组（489.75±96.38）pg/mL。两组中MMP-9和TIMP-1的t值为45.24（P<0.05）和26.40（P<0.05）；LDH和CA15-3的t值为1.57（P>0.05）和 0.96（P>0.05）。酶谱分析显示MMP-9处观察到最明显的条带，而在[金属蛋白酶-2（MMP-2）]处观察到不太明显的条带。根据ROC曲线得出胸腔积液中MMP-9（χ2=3.67）和TIMP-1 （χ2=3.54）与其他标记物相比具有更高的灵敏度（分别为98%和94%）和特异性（分别为92%和96%）。结论 MMP-9和TIMP-1可能是区分良恶性胸腔积液的有效指标。

[关键词] 胸腔积液；基质金属蛋白酶-9；基质金属蛋白酶抑制剂-1

[中图分类号] R730.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2019）01（c）-0026-03

Application of MMP-9 and TIMP-1 in Differential Diagnosis of Benign and Malignant Pleural Effusion

WU Wei-dong， JIANG Feng

Department of Cardiothoracic Surgery， Guangzhou Red Cross Hospital， Jinan University Medical College， Guangzhou， Guangdong Province， 510220 China

[Abstract] Objective To evaluate the accuracy of differential diagnosis of benign and malignant pleural effusions by matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） and matrix metalloproteinase inhibitor-1 （TIMP-1）. Methods A total of 126 patients who met the criteria of February 2017 February 2018， Department of Cardiothoracic Surgery， Guangzhou Red Cross Hospital， were convenient included in the study. MMP-9， TIMP-1， lactate dehydrogenase （LDH） and glucose in 63 cases of malignant pleural effusion （malignant group） and 63 cases of benign pleural effusion （benign group） by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） Antigen 15-3 （CA15-3）. The activity of MMP-9 was detected by substrate zymography. Results MMP-9 levels in the malignant group （1 578.36±133.27）pg/mL were significantly higher than those in the benign group （528.35±127.21）pg/mL. TIMP-1 levels （1 057.46±140.89）pg/mL were also higher than those in the benign group （489.75±96.38）pg/mL. The t values of MMP-9 and TIMP-1 in the two groups were 45.24 （P<0.05） and 26.40 （P<0.05）； the t values of LDH and CA15-3 were 1.57 （P>0.05） and 0.96 （P>0.05）. A zymogram analysis revealed the most pronounced band observed at MMP-9， while a less pronounced band was observed at [metalloproteinase-2 （MMP-2）]. According to the ROC curve， MMP-9 （χ2=3.67） and TIMP-1 （χ2=3.54） in pleural effusion showed higher sensitivity （98% and 94%， respectively） and specificity compared with other markers （92% and 96%， respectively）. Conclusion MMP-9 and TIMP-1 may be effective indicators for distinguishing benign and malignant pleural effusions.

[Key words] Pleural effusion； Matrix metalloproteinase-9； Matrix metalloproteinase inhibitor-1

在临床工作中，良恶性胸腔积液的鉴别诊断很重要，直接影响到治疗手段的选择和患者的预后。脱落细胞学检查对恶性胸腔积液的诊断特异性高，但敏感性低，尤其在疾病早期[1]。电视胸腔镜为鉴别诊断良恶性胸腔积液的金标准，但终究是有创操作，无论是对术者技术还是对患者身体要求来说都比较高，不适合在临床上广泛使用[2]。不同基础疾病导致的胸腔积液机制不同，单一的标记物是不能在所有类型的胸腔积液中发挥作用的。近年来，不断有一些新的标记物被评估，以提高对胸腔积液的诊断准确性[3-5]。该研究旨在评估广州市红十字会医院心胸外科2017年2月—2018年2月收治的126例患者胸腔积液中的MMP-9联合TIMP-1在鉴别诊断良恶性胸腔积液中的应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选取广州市红十字会医院心胸外科收治的符合标准的126例胸腔積液患者为研究对象，分为恶性组和良性组。恶性组63例，纳入标准：①多次经实验室检查确诊为恶性疾病的患者；②采集标本前未行任何针对性治疗。良性组63例，纳入标准：①经实验室检查明确排除恶性肿瘤；②采集标本前未行任何针对性治疗。恶性组男性36例，女性27例，平均年龄（67±6）岁，包括：肺癌18例，乳腺癌12例，胃癌9例，结肠癌12例，食管癌12例；良性组男性30例，女性33例，平均年龄（60±5）岁，包括15例结核性渗出液，48例非结核性漏出液。该研究的方案通过广州市红十字会医院伦理委员会批准，并且纳入研究的所有对象都签署了知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集和处理 通过穿刺收集胸腔积液后，立即将其在4℃下以1300 rpm离心10 min，分离上清液置于-70℃下。

1.2.2 标记物的测定 严格按照上海劲马公司的ELISA试剂盒说明书操作，测定胸腔积液中标记物的浓度。

1.2.3 酶谱分析 将胸腔积液蛋白与样品缓冲液混合后直接施用至含有明胶的丙烯酰胺凝胶。将凝胶置于含NaCl， CaCl2聚氧乙烯月桂醚的缓冲液中在37℃下温育18 h。之后将凝胶置于含考马斯亮蓝的冰醋酸中染色1 h，并在没有染料的相同溶液中脱色2 h。每种胶原酶的明胶分解活性对于染色明胶的蓝色背景都是显示条带。根据酶谱法，对明胶上条带的定性分析转化为定量分析，用凝胶图像分析系统读取条带。

1.3 统计方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。数据以均数±标准差（x±s）表示，使用t检验进行不同组之间的比较。用受试者工作特征（ROC）曲线计算区分恶性组和良性组的变量的准确性。根据ROC曲线，计算灵敏度，特异度。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胸腔积液的标记物水平

恶性组的MMP-9和TIMP-1水平高于良性组，而LDH和CA15-3水平没有明显差异。见表1。

2.2 酶谱分析

恶性组胸腔积液明胶酶谱图上最显著的条带是位于92kDa（MMP-9）；在72kDa（MMP-2）上看到较弱的条带。现随机取其中6个恶性组样品酶谱图，见图1。

2.3 胸腔积液标记物的诊断准确性

表2记录了标记物的ROC曲线的特征。MMP-9水平的敏感性达到98%，特异性为92%。TIMP-1水平的敏感性达到94%，特异性为96%。MMP-9和TIMP-1水平曲线下面积（AUC）都显着高于LDH，差异有统计学意义（P<0.05）和CA15-3（P<0.05）。MMP-9与TIMP-1的AUC之间没有显着差异（P=0.2）。

3 讨论

良恶性胸腔积液的鉴别诊断至今还是十分困难的，因为胸腔积液的形成机制还未彻底掌握。我们发现两组实验中MMP-9和TIMP-1的t值分别为45.24（P<0.05）和26.40（P<0.05）；而LDH和CA15-3的t值分别为1.57（P>0.05）和0.96（P>0.05）。由此，MMP-9和TIMP-1可作为良恶性胸腔积液的鉴别指标。有趣的对比，Park等人[6]发现结核性胸腔积液MMP-9的水平（1 258.16±103.47）pg/mL高于恶性胸腔积液（878.33±89.37）pg/mL，而我们的研究良性组中的15例结核性胸腔积液MMP-9水平（512.45±106.52）pg/mL低于恶性组（1 578.36±133.27）pg/mL。这可能和结核性肉芽肿有关，与非肉芽肿性胸膜活检相比，活检组织中检出肉芽肿的患者MMP-9浓度显著增高。Ondo K等多人[7]研究表明MMP-9的活性形式是评估癌症进展的重要标志。为了量化MMP-9的活性形式，该研究使用了明胶酶谱法，并且在所有恶性组中检测到两种主要的MMPs：MMP-9和MMP-2。结果表明MMP-9呈现出了比MMP-2更高的酶活性，这可能与MMP-9通过降解Ⅳ型胶原破坏血管周围和间皮层基底膜的完整性导致肿瘤的转移及恶性胸腔积液的蓄积这一功能有关[8-9]。Ondo K研究中所得的结果和本实验一样，都是MMP-9呈现出了比MMP-2更高的酶活性。与LDH和CA15-3相比，MMP-9和TIMP-1具有高度特异性（分别为92%和96%），并且还具有高灵敏度（分别为98%和94%）。对比Park等人研究得出的MMP-9特异性和敏感度分别为87%和76%；TIMP-1特异性和敏感度分别为78%和85%。可以认为MMP-9和TIMP-1联合用来良恶性胸腔积液的鉴别是适用的。

4 不足及展望

该研究的样本量少，两组的病种不够全面，得到的结果可能存在较大的偏移。未对恶性组中的同一疾病进行详细的分型分期。为了进一步提高研究的准确性，需要采集更大的样本，更多的疾病种类。我相信，在当今的大数据时代，MMP-9和TIMP-1很快就能被证实用于临床上良恶性胸腔积液的鉴别。

[參考文献]

[1] Bhanvadia MV， Santwani PM， Vachhani JH. Analysis of diagnostic value of cytological smear method versus cell block method in body fluid cytology ： study of 150 cases[J].Ethiop J Health Sci， 2017， 24（2）：125-131.

[2] Alfonso Fiorelli， Serena Ricci， Antonia Feola， et al. Matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in diagnosis of pleural effusion of malignant origin[J]. Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery， 2016，22 ：411-418

[3] Fiorelli A， Rizzo A， Messina G， et al. Correlation between matrix metallopr oteinase 9 and 18F-2-fluoro-2-deoxyglucose-positron emission tomography as diagnostic markers of lung cancer[J]. Eur J Cardiothorac Surg，2016， 41（8）：52-60.

[4] Vatansever S， Gelisgen R， Uzun H， et al. Potent ial role of matrix metalloproteinase-2，-9 and tissue inhibitors of metalloproteinase-1，-2 in exudative pleural effusions[J]. Clin Invest Med，2016，32 （4）： 293-300.

[5] Kremer R， Best LA， Savulescu D， et al. Pleural fluid analy sis of lung cancer vs begin inflammatory disease patients[J].Br J Cancer， 2015，102（7）：1180-1184.

[6] Park KJ， Hwang SC， Sheen SS， et al. Expression of matrix metalloproteinase-9 in pleural effusions of tuberculosis and lung cancer[J].Respiration 2015，72（1）：66-75.

[7] Ondo K， Sugio K， Yamazaki K， et al. The significance of serum active matrix metalloproteinase-9 in patients with non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer，2016，46（2）：5-13.

[8] Gonzales-Avila G， Iturria C， Vadillo F， et al. 72-kD （MMP-2） and 92-kD （MMP-9） type IV collagenase production and activity in different histologic types of lung cancer cells[J]. Pathobiology，2018，66（3）：5-16.

[9] Jin HY， Lee KS， Jin SM， et al. Vascular endothelial growth factor correlates with matrix metalloproteinase-9 in the pleural effusion[J].Respir Med，2017，98（1）：15-22.

（收稿日期：2018-10-26）