李雪贤，李 敏，陈 述，张瑞涛，刘 冰，吴帅帅，于 杰

（国家胶类中药工程技术研究中心，东阿阿胶股份有限公司，山东 东阿 252201）

德州驴，是我国本土五大驴种之一［1］，具有体格高 大、结构匀称、役肉兼用的特点，也是驴种改良及种间杂交的理想品种［2］。近年来，消费者对驴产品的需求量逐渐增加，但毛驴存栏量持续下降，加之落后的繁殖技术，已经严重制约了驴产业的发展。而在马［3］、牛［4］、羊［5］上，冷冻精液与人工授精技术的结合，不仅推动了群体的遗传改良，还极大地提高了牛奶、羊毛等的产量。现阶段，驴繁殖多采用本交的方式，人工繁殖技术研究相对较少。种公驴精液品质的优劣，是其种用价值的直观指标，直接影响母畜的受胎率和群体的繁殖率。已有研究表明，多种因素影响种公驴的精液品质，如季节、体尺、性行为等［6-7］，但年龄对种公驴精液品质影响的研究鲜有报道。本研究充分利用已有数据，着重分析、讨论年龄与种公驴精液品质的关系，旨在确定种公驴精液采集的最适年龄范围，为最大限度地发挥优良种公驴的生产性能、合理制定种公驴的更新年限提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲养管理

本研究选取中国东阿国家黑毛驴繁育中心的42头4～7岁种公驴，对其2018年上半年的采精状况及生产数据进行跟踪与统计分析。种公驴的饲养管理按照繁育中心饲养管理技术规程进行，采用自由饮水、“三定”原则、“先粗后精”的饲喂方式，给予自然光照和安静、卫生的圈舍环境。种公驴采精前先进行调教，“空采”两轮后使用，保证精液质量［7］。

1.2 试验材料与试剂

假阴道，集精杯，恒温水浴锅，量筒，显微镜，载玻片，盖玻片，精液密度测定仪，自制冷冻液，精液分装打印一体机，程序冷冻仪，精液数位分析系统，等等。

1.3 试验设计

将种公驴的生产数据按采精年龄分为4组：4岁组、5岁组、6岁组及7岁组。本研究共收集并整理42头种公驴2018年3—7月共计140 d的采精数据，剔除前两次“空采”记录后，对所得数据进行统计分析。

1.4 精液样品的采集、测定指标及测定方法

使用消毒后的假阴道刺激法进行精液采集，收集精液至集精杯中，称量体积，记录射精量。移液枪取7μL原精，显微镜下观察精子状态，并使用精液数位分析系统测量精子活力，记录快速向前运动的精子数，计算其所占百分比。使用精液密度测定仪检测原精中精子密度。向原精液中按1∶1的比例加入商用稀释液，1 850 r/min，离心10 min，弃上清液。用精液冷冻保存液重悬精子［8］，使用细管灌装打印机分装精液至0.5 mL冻精细管中，4℃冷藏柜中平衡2～3 h，用全自动程序冷冻仪快速冷冻精子，并投入液氮中长期保存。每批冷冻样品均进行解冻复检，检测精子解冻活力，计算复苏率。

1.5 数据统计

所有数据均以平均值±标准差（Mean±SD）表示。采用SPSS 20.0软件中的单因素方差分析（One-way ANOVA）以及邓肯（Duncan）多重比较对所得数据进行显著性检验，当P＜0.05时，认为差异显著。采用SPSS 20.0软件中的相关性分析对所得数据进行相关性分析，当P＜0.01时，表示具有极显著相关性。

2 结果与分析

2.1 不同采精年龄对种公驴总精液量的影响

如图1所示，以6岁组的种公驴精液采集量为最高，均值超过65 mL，且显著高于4岁组（P＜0.05）和5岁组（P＜0.05）。7岁组的总精液量有所下降，但与6岁组并不存在显著性差异（P＞0.05），与4岁组和5岁组间差异显著（P＜0.05）。

图1不同采精年龄下种公驴的总精液量

2.2 不同采精年龄对种公驴精子密度的影响

如图2所示，种公驴精液中精子密度随着采精年龄的增加而逐渐下降。当采精年龄为4岁组和5岁组时，种公驴精子密度的平均值之间并无显著差异（P＞0.05），但二者均显著高于6岁组（P＜0.05）和7岁组的精子密度（P＜0.05）；而在采精年龄为6岁组和7岁组的精液中，精子密度差异并不显著（P＞0.05）。

图2不同采精年龄下种公驴精液中的精子密度

2.3 不同采精年龄对种公驴精子活力的影响

由表1可知，种公驴采精年龄并不影响精子的原精活力，各组精子活力不存在显著性差异（P＞0.05）；而经过冷冻再解冻后，精子活力呈现升高趋势，当采精年龄为6岁和7岁时，精子的冻后活力均显著高于4岁组（P＜0.05）和 5岁组（P＜0.05），但二者之间并无显著性差异（P＞0.05）；采精年龄为5岁时，精子的冻后活力略高于4岁组，但差异不显著（P＞0.05）。

表1不同采精年龄对种公驴精子活力的影响

2.4 不同采精年龄对种公驴精子冷冻复苏率的影响

如图3所示，随着采精年龄的增加，种公驴精子冷冻后再复苏的合格率逐渐增加。当采精年龄为6岁组时，精子的冷冻复苏率超过80%，显著高于4岁组（P＜0.05）和 5岁组（P＜0.05），略高于 7岁组，但差异并不显著（P＞0.05）；而4岁组和5岁组均显示较低的复苏率，且二者之间并无显著性差异（P＞0.05）。

图3不同采精年龄下种公驴精子的冷冻复苏率

2.5 采精年龄与种公驴精液各指标之间的相关性

由表2可知，种公驴的采精年龄与精液总量、冻后活力和复苏率均呈极显著的正相关性（P＜0.01），与精子密度则呈显著的负相关性（P＜0.05）。此外，总精液量与精子密度之间、冻后活力与复苏率之间均存在极显著的相关性（P＜0.01），而原精活力与精子密度也存在显著的相关性（P＜0.05）。

表2采精年龄与精液各指标之间的相关性

3 讨论

德州驴12～15月龄即可达到性成熟，24～36月龄达到体成熟，生产中一般在2.5岁时开始调教采精［9］，3～8岁是种公驴一般使用的年龄范围。但以往的研究发现，虽然刚刚性成熟的公畜就能够射出具有受精能力的精液，但是其不完善的组织、器官和身体机能，阻碍了它精液质量的提升，而且过早使用种公畜，会导致其过分疲劳，爬跨无力［10］；而种公畜使用年限太长，生殖器官机能衰退，又可能降低精液品质，影响母畜受孕率［11］。因此，明确采精年龄对种公畜精液各项指标的具体影响就显得至关重要。

已有报道指出，种公畜的年龄与精液质量密切相关。Travi等［12］研究发现，公牛的精液产量和质量会随着年龄的增长而提高。Ahmad等［13-14］报道，相比青年和老年公牛，壮龄种公牛具有更强的性欲，更大的射精量。在本研究中，随着采精年龄的增长，种公驴采集的总精液量逐渐增加，以6岁组为最高，均值超过65 mL，且显著高于 4岁组（P＜0.05）和 5岁组（P＜0.05）。但是较大的射精量并不一定表明它具有更高的精子浓度。David等［15］研究发现，种公羊的精子密度在2～3岁时即达到最大，此后随年龄增长而逐渐下降。这与本研究的结果相一致，种公驴精液中精子密度随着采精年龄的增加而逐渐下降，4岁组和5岁组的精子密度均显著高于6岁组（P＜0.05）和 7岁组（P＜0.05），与射精总量呈现相反的趋势。将种公驴总精液量和精子密度进行相关性分析可知，二者呈极显著的负相关性（P＜0.01）。进一步研究发现，年龄处于壮龄的种公畜，精液中活精子百分比最高且畸形率最低［5，16］。说明虽然种公驴精液中精子密度较小，但是可能具有较多的有效精子数。而随着年龄增长，上升的总精液量和下降的精子密度，共同维持了稳定的总精子数。

一般认为，精子活力是精液中进行前进运动精子所占的百分率。已有研究指出，随着年龄的增长，种公畜精子活力会呈现逐渐下降的趋势［17-18］。然而 Joshi等［19］的研究结果表明，种公畜年龄的大小对其精子活力并未产生显著影响。但在家禽上的研究表明，与成年家禽对比，青年家禽的精子质量更差，对冻融过程中的温度变化更敏感［20］。本研究发现，随着年龄的增长，种公驴的原精活力略有下降，但几个年龄段之间并不存在显著差异（P＞0.05），而精子的冻后活力和冷冻复苏率却随着年龄的增长而显著上升（P＜0.05），且二者与年龄之间均存在极显著的相关性（P＜0.01）。该研究结果提示，随着种公驴年龄的增长，其精子整体质量变好，对温度的敏感性减弱，而其中是否存在一定的抗冻性，还需要进一步研究。

4 结论

①从种公驴采集的总精液量、精子的冻后活力及复苏率3方面考虑，最佳采精年龄为6岁；从精子密度方面分析，最佳采精年龄为5岁。②种公驴的采精年龄与总精液量、精子冻后活力及复苏率之间均呈极显著的正相关性（P＜0.01），与精子密度间存在显著的负相关性（P＜0.05）。因此，合理安排种公驴的采精频率，可以获得稳定的精液质量。综合以上各项指标，建议用于人工繁殖的核心群公驴采精年龄以6～7岁为宜，以保证充足的精液量和较好的冻后活力。