杨富金 李 敏 高燕妮 江 雪 刘 毅

重庆市中医院皮肤科，重庆 400011

特应性皮炎(Atopic Dermatitis,AD)是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，患者往往有剧烈瘙痒表现，严重影响其生活质量[1]。其发病机制十分复杂，涉及遗传因素，皮肤屏障的缺陷，免疫功能失调[2]。湿敷是中医临床上常用的一种外治法，湿敷是可以增加皮肤的水合作用，从而促进药物的吸收作用；可使局部毛细血管收缩，皮损局部充血减轻；还可吸收渗出液，保护和清洁患面，从而减轻炎症，是一种安全有效的治疗手段。甘草GlycyrrhizaeRadix(GR)，甘、平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效。甘草提取物及其黄酮类化合物、甘草酸等对皮肤炎症、变态反应性皮肤病、皮肤肿瘤、病毒性皮肤病、色素沉着等皮肤病均有药理活性[3]。马齿苋PortulacaeHerba(PH)，酸、寒，归肝、大肠经，具有清热解毒、凉血止血、止痢之功效，其水提液湿敷具有清热解毒、散血消肿之功，可治疗多发性疖肿、脓包疮、急性湿疹、过敏性皮炎、接触性皮炎等皮肤病[4-6]。二者配伍取“酸甘化阴”之意，功在滋阴养胃，两者一敛一滋，起协同作用，用治阴虚不足证。

我科在长期临床外治治疗中，总结经验将二者合用湿敷治疗特应性皮炎取得了较好的疗效，但是缺乏系统科学的基础研究。本实验以甘草和马齿苋为研究对象，探索甘草和马齿苋单独用药和配伍用药后对AD小鼠模型免疫调节的作用，考察单独用药、减半配伍、不减半配伍之间的量效关系，为临床应用和进一步的制剂开发提供必要的药效学数据支撑。

1 仪器与材料

1.1 仪器 液相色谱仪(美国Agilent 1260)，PCR扩增仪(美国Bio-RAD MJ mini)，实时荧光定量PCR(瑞士Roche Light Cycler 480)，酶标仪(Bio-Rad iMark)，荧光倒置显微镜(德国莱卡DMIL-FL-EL6000)。

1.2 药物与试剂 甘草(批号：170801)、马齿苋(批号：170901)购于重庆慧远药业有限公司，经鉴定分别为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch的干燥根和根茎，马齿苋科植物马齿苋PortulacaoleraceaL的干燥地上部分。甘草苷对照品(批号：111610-201607，中国食品药品检定研究院)；甘草酸铵对照品(批号:110731-201720,中国食品药品检定研究院);1-氯-2,4-二硝基苯(DNCB)为西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(瑞士Roche公司)；荧光定量PCR试剂盒LightCycler 480 SYBR GreenⅠMaster(瑞士Roche公司)。

1.3 动物 6～8周龄SPF级BALB/c小鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号SCXK(京)2014-0004。

2 方法

2.1 甘草马齿苋提取物的制备 分别称取各组相应质量的药材，甘草组100 g，马齿苋组100 g，甘草马齿苋配伍低剂量组甘草50 g加马齿苋50 g，甘草马齿苋配伍高剂量组甘草100 g加马齿苋100 g。浸泡半小时，加20倍量水，煎煮2次，每次30 min，合并药液，浓缩至相应浓度，甘草组药液浓度为0.2 g/mL，马齿苋组药液浓度为0.2 g/mL，配伍低剂量组药液浓度为0.2 g/mL，配伍高剂量组药液浓度为0.4 g/mL,应用高效液相法检测。甘草组中甘草苷和甘草酸的含量分别为0.329 mg/mL、1.353 mg/mL，配伍低剂量组为0.221 mg/mL、0.729 mg/mL，配伍高剂量组为0.371 mg/mL、1.432 mg/mL。甘草组浸膏得率为34.6%，马齿苋组为26.71%，配伍低剂量组为35.36%，配伍高剂量组为33.34%。

2.2 DNCB诱导小鼠AD模型的建立、分组及给药 健康六周龄雌性BALB/c小鼠60只随机分为6组，正常对照组、DNCB模型组、甘草组、马齿苋组、配伍低剂量组、配伍高剂量组，每组10只。动物AD模型构建[7]及中药干预流程如图1，小鼠于实验0天脱毛处理，实验第一周和第二周给予每周两次的1%DNCB(100 μL)刺激，实验第三周和第四周给予每周两次的0.5%DNCB(100 μL)刺激，于实验第三周至实验结束期间进行中药干预，每天早晚用棉签涂擦相应药液一次，实验结束后摘眼球取血、并摘取脾脏及皮损用于检测。

2.2 皮肤厚度测量 第29天实验结束时采用游标卡尺测量每只小鼠皮肤厚度，测量时分别选取不同部位，测量五次计算平均值。

2.3 脾脏指数 取各组小鼠脾脏称重，以每10 g小鼠的脾重作为脾脏指数，脾脏指数=[脾脏质量(mg)/体重质量(g)]×10。

2.4 HE染色 取各组小鼠皮损组织，置于中性甲醛中固定24 h。80%、90%、95%、无水乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色，中性树胶封片，光镜下观察。

2.5 酶联免疫吸附法测定 取出备用的小鼠血清，严格按照IgE、IL-4、IL-6 ELISA试剂盒(联科生物技术股份有限公司)说明书操作，显色终止立即在酶标仪上测定吸光度值，制作标准曲线，按曲线换算样品中IgE、IL-4、IL-6浓度。

2.6 半定量RT-PCR检测 收集各组小鼠组织，采用TRIzol法提取皮损总RNA，根据Roche公司试剂盒进行逆转录合成双链cDNA。再以cDNA为模版，Real-time PCR实时检测荧光强度。引物序列由生工生物工程有限公司合成。10 μL的PCR反应体系包括2×PCR buffer 5 μL、ddH2O3μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；溶解曲线95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s；冷却50 ℃ 30 s，引物条件见下表。

表1 各目标基因引物序列

2.7 统计学分析 实验数据及图片制作采用GraphPad prism软件和SPSS13.0软件进行分析，多组间均数的比较采用One-way ANOVA分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 药物干预对DNCB诱导的小鼠模型的影响

3.1.1 小鼠皮损情况 连续观察29 d，正常对照组背部皮肤无明显变化，模型组前期经DNCB高浓度(1%)刺激后出现水肿、红斑、血痂，及搔抓，后期DNCB低浓度(0.5%)刺激后出现红斑及鳞屑，经中药干预治疗后可见红斑淡化，无明显的鳞屑及血痂(见图2A)。

3.1.2 小鼠皮肤厚度 正常对照组皮肤厚度值为(0.508±0.01)mm，DNCB模型组皮肤厚度值为(1.46±0.19)mm，甘草组皮肤厚度值为(0.99±0.03)mm，马齿苋组皮肤厚度值为(1.21±0.10)mm，配伍低剂量组皮肤厚度值为(1.23±0.13)mm，配伍高剂量组皮肤厚度值为(0.85±0.47)mm，和配伍低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)(见图2B)。

3.1.3 脾脏指数 正常对照组脾脏指数为33.49±1.39，DNCB模型组脾脏指数为47.53±3.67，甘草组脾脏指数为37.81±1.58，马齿苋组脾脏指数为44.06±1.01，配伍低剂量组为34.46±1.04，配伍高剂量组为33.96±2.41(见图2C)，和配伍低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3.2 药物干预对背部皮肤组织形态学的影响 由图3中HE染色结果可见，正常对照小鼠背部皮肤组织厚度正常，各层次清晰，几乎无炎症细胞浸润；DNCB模型组皮肤组织表皮增厚，棘层和基底层有明显的炎症细胞浸润，可见中性粒细胞、淋巴细胞，组织间隙水肿。中药干预后各组皮肤组织厚度较模型组降低，炎症细胞浸润明显减少，特别是甘草和马齿苋配伍的高剂量组最为明显。

3.3 ELISA检测血清IgE和Th2型细胞因子的表达 产生IgE是湿疹的一个重要特点，应用DNCB反复刺激的小鼠血清同正常对照组比较总IgE明显升高(P<0.001)(见图4A)；DNCB模型组的浓度为(774.82±22.60)ng/mL，和正常对照组为(546.13±14.31)ng/mL；应用甘草组和马齿苋可抑制IgE的升高，单独用药比较马齿苋组优于甘草组(P<0.01)，配伍高剂量(620.00±34.17)ng/mL的和配伍低剂量组(691.39±21.19)ng/mL比较无统计学意义。在血清Th2细胞因子IL-4的含量测定中(见图4B)，DNCB模型组的浓度为(34.36±0.23)pg/mL，同空白组(31.88±0.29)pg/mL比较显著提高(P<0.001)；药物干预后可降低IL-4，单独用药马齿苋组和甘草比较差异无统计学意义(P>0.05)，配伍高剂量组(30.99±0.48)pg/mL抑制炎症效果优于配伍低剂量组(P<0.001)。前炎症因子IL-6(见图4C)空白组的浓度为(73.91±2.34)pg/mL，DNCB模型组浓度(143.26±1.27)pg/mL显著升高(P<0.001)；甘草和马齿苋干预后可减低血清IL-6，独用药比较甘草优于马齿苋(P<0.001)，配伍高剂量含量最低为(83.23±2.31)pg/mL，抑制炎症效果优于配伍低剂量组(P<0.001)。

3.4 Q-PCR检测皮损中Th1/Th2型细胞因子的mRNA表达 AD是以Th2型细胞因子优势表达为特点的慢性皮肤病，Th2胞分泌的IL-4、IL-5、IL-6、IL-13，本研究考察了Th1细胞分泌的IFN-γ，Th2胞分泌的IL-4、IL-6、IL-13炎症因子的mRNA表达。结果如图5见IL-4、IL-6、IL-13、IFN-γ炎症因子DNCB组的表达同空白对照组比较有显著性的提高(IL-4, IFN-γ,P<0.01；IL-6、IL-13,P<0.001)；单独应用甘草或马齿苋都有不同程度的抑制炎症因子表达的效果，且甘草组表现优于马齿苋组；配伍应用后抑制炎症的效果更佳，且配伍高浓度组的抑制效果均强于配伍低浓度组，在IL-13(P<0.05)和IL-6(P<0.001)的因子表达中配伍高剂量组同配伍低剂量组比较有统计学差异；配伍高剂量组同DNCB组比较对IL-4、IL-6、IL-13、IFN-γ的抑制率分别为62.9%、93.0%、78.2%、53.0%。

4 讨论

药对配伍是中药复方的最小单位，是根据药物的性味归经、升降沉浮，选择性地将两味中药进行配对，其配伍蕴涵着丰富的客观规律。药对配伍研究一直是传统中药研究的热点，目前研究多以有效成分的含量测定为切入点，并结合现代药理学、分子生物学、蛋白组学及代谢组学等方法深入阐明其作用机制及量效关系，揭示两药配伍内在本质和科学内涵[8-9]。

AD的病因尚不清楚，发病机制十分复杂，免疫学发病机制认为其与Th1/Th2免疫失衡有关。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α，并介导细胞免疫；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13，并介导体液免疫[10-11]。参与AD发病的细胞因子众多，促炎症因子IL-6、IL-10也起到重要作用[12-13]。研究表明IgE的升高可引起皮肤的急慢性炎症改变，血清中总IgE升高是AD的重要标志，并且血清中与Th1、Th2相关[14]。此外，IL-4和IL-13可促进B细胞的增殖和诱导B细胞生成IgE，在IgE的调节中起到重要作用[15]。基于此，本课题选择了IgE、IL-4、IL-6、IL-13及 IFN-γ作为指标进行试验。

本实验以DNCB刺激诱导的AD小鼠模型为研究对象，局部应用甘草和马齿苋配伍的药物，首先观察其对AD炎症反应的影响。结果显示，药物干预后可改善临床症状，尤其是两种药物配伍的高浓度组可显著抑制皮肤增厚，降低脾脏指数。免疫器官是特异性免疫应答的场所，该指数能够在一定程度上反映机体的免疫功能状态。因此，该结果表明甘草和马齿苋配伍可以通过下调机体细胞免疫应答和免疫器官脏器指数发挥一定的免疫抑制作用。结合AD的免疫学发病机制，进一步检测了 Th1/Th2相关细胞因子的表达水平，探讨了甘草、马齿苋两味药单独和配伍应用对模型小鼠的免疫调节作用，结果发现，两味药单独和配伍应用均可减轻模型小鼠的临床症状，改善皮损情况，抑制皮肤增厚，减轻炎症，可抑血清IgE、IL-4、IL-6的升高，降低皮损中IL-4、IL-6、IL-13及IFN-γ细胞因子的mRNA的表达。研究发现配伍应用后治疗效果提高，并与给药浓度有关，即配伍高剂量组优于配伍低剂量组，但最佳配伍比例及药物浓度有待进一步研究。

综上所述，本研究通过观察临床症状和组织形态学变化情况，以及检测Th1/Th2相关细胞因子的表达水平，观察了甘草、马齿苋两味药对AD模型小鼠的治疗作用，为临床应用提供了实验依据。