王胜锋 黄毅 廖芬艳 曾红宇 许岗

摘 要：该文提出了一种基于酶法转化乳酸制备D-丙氨酸的方法。首先，采用乳酸氧化酶催化氧化乳酸生产丙酮酸，然后利用D-氨基酸脱氢酶将丙酮酸还原成D-丙氨酸，在此过程中加入D-氨基酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和NADP，构建了辅酶再生体系。乳酸被氧化过程中会产生副产物过氧化氢，会导致丙酮酸的降解，通过添加过氧化氢酶除去过氧化氢。通过优化工艺条件，D-丙氨酸的转化总摩尔收率能达到64.9 %，产品的ee值达到99.9 %。该研究制备D-丙氨酸相对于传统方法，具有工艺环保、成本低，质量好等优点，适用于工业化生产。

关键词：乳酸；乳酸氧化酶；丙酮酸；D-氨基酸脱氢酶；甲酸脱氢酶；D-丙氨酸

中图分类号：Q935 文献标志码：A

0 前言

D-丙氨酸作为一种重要的手性化合物，已经在制药、食品、化妆品等领域得到广泛应用。它是生产维生素B6的原料，有镇痛的作用；还是一种甜味剂，是合成二肽阿力甜的重要原料。同时，它还有抑菌的作用，可用作化妆品的添加剂等。

常规D-丙氨酸的生产方法主要有微生物发酵法和化学合成法。微生物发酵法生产周期长、投资大，且制备的D-丙氨酸光学纯度不高。化学法主要有不对称合成和手性拆分的方法，不对称合成需要较为昂贵的催化剂，成本高，不适用于大规模生产。手性拆分原料成本高，且有一半的L-丙氨酸需要去除，手性纯度难以保证。以5-甲基海因为底物通过外消旋后，再用海因酶和氨甲酰水解酶制备D-丙氨酸，此方法消旋速度慢，条件苛刻，难以工业化。

酶法合成D-丙氨酸工艺以其高效催化、绿色环保等特点引起了研究者的关注。最近，朱敦明课题组报道了采用以α酮酸为底物，利用共固定化的二氨基庚二酸脱氢酶和甲酸脱氢酶制备D-丙氨酸，该方法以NADH为辅酶，催化α酮酸直接转化为D-丙氨酸，产品光学纯度>98 %。该工艺的不足之处是采用酮酸为原料，成本较高。该文针对该方法的缺点开发了一种酶法制备D-丙氨酸的新方法。采用价格比丙酮酸低10倍的廉价材料乳酸为底物，先采用乳酸氧化酶（LOD）催化乳酸制备丙酮酸，然后采用D-氨基酸脱氢酶（DAADH）和NADP（H）转化丙酮酸为D-丙氨酸。中间加入甲酸脱氢酶（PFDH），与DAADH和NADP（H）构成了辅酶再生体系，转化过程如图1所示。该方法成本较低、产品光学纯度高，适用于工业化大生产。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

试剂：过氧化氢酶，0.3 Mu/mL，山东泰安信得利生物工程有限公司。固定化LOD，100 U/g，PFDH，30 U/mL，DAADH，114 u/mL，均由湖南福来格生物技术有限公司生产。乳酸，含量80 %，河南金丹乳酸科技股份有限公司。其他试剂均为分析纯。实验所用的水均为超纯水。

仪器：氧化反应器，上海保兴。高效液相色谱，Agilent 1100。旋转蒸发仪，上海亚荣RE-2000A。

1.2 实验方法

1.2.1 酶催化制备乳酸

将pH为7.0浓度为6 %的乳酸溶液导入氧化反应器中。然后加入一定量的过氧化氢酶，搅拌0.5 h。取一定量的LOD导入氧化反应器中，通入氧气，开启反应。取样做HPLC分析，当乳酸的残留小于2 mg/mL时，停止搅拌和通氧，反应停止，过滤出反应液。

1.2.2 酶催化制备D-丙氨酸

在过滤的丙酮酸溶液中加入2倍丙酮酸摩尔量的甲酸铵，并开启搅拌，调节pH到7.0，将一定量的PFDH、DAADH以及NADP加入转化料液中，开启反应。取样做HPLC分析，当丙酮酸的残留小于2 mg/mL时，停止搅拌，反应停止，采用5K的超滤膜过滤出反应液。

1.2.3 结晶

上述超滤得到的溶液，加入3 ‰活性炭脱色0.5 h，过滤后升温浓缩，浓缩到一定濃度后，倒入玻璃烧杯中，冰浴降温到5 ℃后，过滤，干燥，得到D-丙氨酸成品。

2 结果和讨论

2.1 过氧化氢酶加量对LOD催化收率的影响

在LOD氧化乳酸生成丙酮酸的过程中，会产生H2O2，H2O2会对酶产生不利影响，同时也会导致丙酮酸的降解，通过在转化体系中加入过氧化氢酶去除H2O2。该研究考察了过氧化氢酶加量对转化收率的影响。其他反应条件为：乳酸浓度6 %，LOD投量为6 000 u/mol，反应温度30 ℃，pH 7.0。结果如图2所示。

由图2可知，当过氧化氢酶浓度达到0.15 Mu/mol时，转化的收率基本达到稳定值，继续提高过氧化氢酶的浓度，转化的收率基本无增长，因此选择最佳的过氧化氢酶浓度为0.15 Mu/mol。

2.2 LOD投量对转化的影响

该研究考察了酶添加量对转化反应的影响。其他反应条件与2.1所述一样。结果如图3所示。

由图3可知，当LOD的加量越大，转化所需时间越短。当氧化酶投量为12 500 u/mol时，氧化反应在2 h内基本达到平衡，此时的收率仅为40 %。当酶的加入量小于8 500 u/mol时，反应达到平衡的时间延长至5 h～6 h，收率也在逐步提高。由于酶的投量越大，反应越剧烈，需要的过氧化氢酶的用量也要增加，综合考虑转化时间和酶应用的经济性，酶的投量选择6 000 u/mol。

2.3 PFDH和DAADH投量对转化速度的影响。

该研究考察了PFDH和DAADH投量对转化反应的影响，PFDH和DAADH投量以1︰1的比例投入。其他反应条件为丙酮酸浓度4 %，NADP投量0.06 g/mol，反应温度为30 ℃，pH为7.0。结果如图4所示。

由图4可知，当PFDH和DAADH加量达到12 000 u/mol后，反应5 h基本达到平衡，收率≥80 %。基于经济性的考虑，选择PFDH和DAADH投酶量为24 000 u/mol。

2.4 最优条件下制备D-丙氨酸的數据分析

在最优条件下，乳酸浓度6 %，LOD投量为6 000 u/mol，过氧化氢酶0.15 Mu/mol；PFDH和DAADH投量为24 000 u/mol以及NADP量为0.06 g/mol，两步转化结果如图5所示。

从图5可以看出，乳酸氧化成丙酮酸的摩尔收率为70.8 %，丙酮酸转化成D-丙氨酸的收率为92.1 %，总收率为65.2 %。

将转化后的料液进行结晶处理，得到成品，经检测，成品的ee值可达99.9 %，说明该工艺能够制备出高纯度的D-丙氨酸。

3 结论

该文提出了一种两步酶法催化乳酸制备成高纯度的D-丙氨酸的方法，通过优化各酶投加量等条件，在保证工艺经济性的同时，提高了转化的收率。其中乳酸氧化成丙酮酸的收率达到70 %，丙酮酸制备成D-丙氨酸的收率达到80 %，通过分离结晶后，制备成了高手性纯度的D-丙氨酸，其ee值达到了99.9 %以上。

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