李朋发 ，杨龙，李桂龙 ，徐后娟，王玉军，李忠佩

1 中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室，南京市北京东路71号 210008；

2 中国科学院大学，北京市石景山区玉泉路19号 100049；

3 山东农业大学植物保护学院，泰安市岱宗大街61号 271018

烟草土传病害严重危害我国的烟叶生产[1]。目前，对烟草土传病害的研究主要集中在三个方面，一是烟草病原菌的致病机理[2-4]；二是植烟土壤微生物群落组成和多样性[5-6]；三是烟草病害的综合防治措施[7-9]。而对于烟草土壤微生物群落功能的研究则鲜有报道。弄清烟草土壤微生物群落功能有助于深入了解烟草发病机理。

烟草根际土壤微生物种类繁多，其中真菌是重要的组成部分。受限于技术手段，对烟草根际真菌群落的研究也基本上都集中在群落组成和多样性上[10-11]。FUNGuild[12]是一个进行真菌功能比对的数据库，不仅可对真菌的营养类型进行鉴定，还能对真菌进行具体的功能分类。FUNGuild在真菌群落研究中得到了较为广泛的应用[13-14]。本研究联合使用Illumina高通量测序技术和FUNGuild软件，研究了镰刀菌根腐病烟株与未发病烟株根际土壤真菌群落的组成和功能，旨在深入了解镰刀菌根腐病发生的土壤微生物学机理，为镰刀菌根腐病的控制提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采样地位于山东省临沂市沂水县（35°97′N，118°37′E），该地区年均气温为13.0℃，年均降水量875mm。样地为坡地，坡顶为林地，坡中和坡底为多年撂荒的新垦烟地，土壤类型为僵心棕堰土。坡中烟地中的烟株大规模发病，经鉴定为镰刀菌根腐病，平均发病率在95%以上。坡底烟地中的未见镰刀菌根腐病发病烟株。坡中土壤基本理化性质为：pH 6.41，有机碳8.42 g·kg-1，总氮 0.89 g·kg-1，总磷0.96 g·kg-1，总钾17.21 g·kg-1，碱解氮 86.65 mg·kg-1，速效磷83.38 mg.kg-1，速效钾 103.17 mg·kg-1；坡底土壤基本理化性质为：pH 6.38，有机碳8.46 g.kg-1，总氮 0.92 g·kg-1，总磷0.97 g·kg-1，总钾17.34 g·kg-1，碱解氮 84.75 mg·kg-1，速效磷85.64 mg·kg-1，速效钾 105.83 mg.kg-1。坡中与坡底土壤在理化性质上无显著差异。

在坡中、坡底各分别随机选择3块烟地，每个地块分别随机选取5株烟株，取烟株根际土并将同一地块采集的根际土混合。将采集好的土壤样本加冰袋低温运输至实验室。将土样分为两部分，其中一部分立即放入-20℃冰箱保存，用于DNA提取；另一部分过2 mm筛并风干，研磨后过0.149 mm筛，用于土壤理化性质分析。

1.2 土壤DNA提取及PCR扩增

土壤DNA使用MP Fast®DNA试剂盒提取（MP Biomedicals，CA，USA），提取方法参考试剂盒使用说明书。提取的DNA使用PowerClean®DNA Clean-up Kit（MoBio，CA，USA）进 行 纯化。DNA浓度和纯度使用NanoDrop ND-1000分光光度计检测，结果显示，经过纯化的DNA浓度 均 在30 ng·µL-1以 上，OD260/OD280均 在1.8-2.0之间，浓度和纯度均符合ITS扩增要求。使用内转录间隔区1（ITS1）的特异性引物（ITS1-F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA[15]/ ITS2-R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC[16]）对6个DNA样本分别扩增，PCR体系和条件参考Li的方法[17]。

1.3 Illumina测序及序列处理

使用Illumina MiSeq PE250测序平台对扩增产物进行双端测序。测序数据经过Flash[18]和Trimmomatic[19]进行拼接和质控后，使用微生物生态学定量研究平台（Quantitative Insights into Microbial Ecology ，QIIME）进行处理。使用UCLUST[20]软件对各序列在97%的相似性水平下聚类操作分类单位（operational taxonomic units，OTUs），各个OTU的代表序列使用UNITE数据库（https://unite.ut.ee/）进行物种信息比对[21]。

1.4 数据处理与分析

真菌的营养型、功能分组使用FUNGuild（1.0）软件进行比对，大体步骤为：（1）将QIIME输出的OTU表和物种信息表合并，将物种信息附加在OTU表的最后一列并命名为“taxonomy”；（2）将第（1）步得到的表格上传到FUNGuild网站，开始比对；（3）比对完成后下载输出结果到本地。输出结果包含原始的OTU表并依据序列数量进行排序。输出结果还包含物种的分类单位“Taxon”，物种分类级别“Taxon Level”，营养型“Trophic Mode”，功能分组“Guild”，可信度“Confidence”，生长形态“Growth Morphology”，特征“Trait”，备注“Notes”和比对信息来源“Citation/Source”。

OTU数、OTU相对丰度等使用R语言（3.4.3）进行聚类计算，主坐标分析（Principal coordinate analysis ，PCoA）、ANOSIM检验也通过R语言（3.4.3）进行。样本的描述性分析、组间差异的显著性分析使用SPSS 19.0中的独立t检验完成。所有图片均通过Origin（9.1）制作。显著性检验水准均为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 根际真菌群落结构及多样性比较

经过质控，6个样本共得到184,782条高质量序列。在97%的相似性水平下聚类OTU，每个样本按照样本最少序列数抽平到14,644条序列，6个样本共聚类得到600个OTU，其中有444条代表序列通过UNITE数据库比对可鉴定为真菌。

在纲水平下对各样本的物种进行分类求和，得到各样本在纲水平下的物种组成，如图1所示。通过图1可以看出，未发病（H）与镰刀菌根腐病（S）烟株的根际真菌群落在物种组成上明显不同。未发病烟株根际真菌群落中，散囊菌纲（Eurotiomycetes）为优势菌纲，平均占比为42.81%，粪壳菌纲（Sordariomycetes）次之，平均占比为13.97%。发病烟株根际真菌群落中则正好相反，粪壳菌纲（Sordariomycetes）平均占比为55.06%，粪壳菌纲（Sordariomycetes）平均占比为14.61%。发病烟株根际真菌群落中的伞菌纲（Agaricomycetes）和鸟纲菌纲（Orbiliomycetes）比例均显著高于未发病烟株（P＜0.05），但是座囊菌纲（Dothideomycetes）的相对丰度在两组真菌群落中无显著差异（P＞0.05）。主坐标分析（PCoA）结果显示，未发病和发病烟株根际真菌群落显著分异。进一步通过ANOSIM检验发现，两组烟株根际真菌群落的组间差异显著大于组内差异（P＜0.05）。

图1 未发病（H）和镰刀菌根腐病（S）烟株根际真菌群落在纲水平上的组成Fig.1 Composition of rhizospheric fungal community in group H (unaffected tobacco) and group S (Fusarium root rot diseased tobacco)

图2 两组烟株根际真菌群落组成的主坐标分析Fig.2 Principal coordinate analysis (PCoA) of rhizosphere fungal communities of group H and group S

分别选取Shannon-Wiener指数、Chao1指数和Observed OTUs指数描述两组烟株根际真菌群落的多样性，结果如表1所示，未发病组的三种α多样性指数（Alpha diversities）均显著高于镰刀菌根腐病组（P＜0.05），说明未发病烟株根际真菌群落的多样性显著高于镰刀菌根腐病发病烟株。

表1 两组烟株根际真菌群落多样性对比Table 1 Comparison of Alpha diversities of rhizosphere fungal communities between group H and group S

2.2 根际真菌群落营养型比较

根际FUNGuild数据库的比对结果，对两组烟株根际真菌的营养型（trophic mode）进行分类统计，结果如图3所示，未发病烟株根际真菌的营养型以腐生营养型（saprotroph）为主，平均占比46.10%，病理营养型（pathotroph）次之，平均占比22.85%；镰刀菌根腐病烟株根际真菌的营养型则以病理营养型为主，平均占比54.64%，腐生营养型次之，平均占比12.88%。两组烟株根际的病理营养型真菌和腐生营养型真菌的相对丰度均具有显著性差异（P＜0.05）。两组烟株根际的共生营养型真菌相对丰度均不足1%，但是未发病烟株根际的共生营养型真菌相对丰度显著低于镰刀菌根腐病烟株（P＜0.05）。另外，未发病烟株根际有相对更多的真菌营养型尚未鉴别。

图3 两组烟株根际真菌群落的营养型组成Fig.3 Trophic composition of rhizosphere fungi communities of group H and group S

2.3 根际真菌病原菌群落比较

在600个OTU中，共有21个OTU经FUNGuild鉴定为植物病原菌（Plant pathogen），其中有6个OTU的鉴定结果可信度（Confidence Ranking）为“Possible”，因此仅对剩余15个鉴定结果可信度为“Probable”和“Highly probable”的高可信病原菌OTU进行分析。

15个高可信度的病原菌OTU分别来自12个菌属，其中，镰刀菌属（Fusarium）、赤霉属（Gibberella）和青霉菌属（Penicillium）均有2个OTU被鉴定为高可信病原菌且镰刀菌属的两个OTU均为腐皮镰孢菌（F.solina），其它9个菌属均仅有1个OTU被鉴定为高可信病原菌。在所有高可信病原真菌中，镰刀菌占据绝对优势地位。在未发病组中，2个镰刀菌OTU的序列数占病原菌序列总数的75.02%±10.67%，而在镰刀菌根腐病组中，2个镰刀菌OTU的序列数占病原菌序列总数的99.10%±0.80%。镰刀菌根腐病烟株根际的镰刀菌在序列数和相对丰度上均显著高于未发病组（P＜0.05）。对两组烟株根际高可信病原菌OTU进行统计，结果如图4所示。未发病烟株根际病原真菌相对丰度平均为1.12%，而镰刀菌根腐病烟株根际病原真菌相对丰度则高达30.73%，差异显著（P＜0.05）。

图4 两组烟株根际病原菌相对丰度Fig.4 Relative abundance of rhizospheric pathogens of two groups

3 讨论

根际微生物区系被称为植物的第二基因组，对植物的生长发育有决定性的影响[22]。本研究分析了镰刀菌根腐病发病烟株与未发病烟株根际土壤的ITS测序结果，发现两种根际土壤的真菌群落组成有显著差异，未发病烟株根际真菌多样性显著高于发病烟株，这与李小龙等对青枯病烟株根际真菌群落的研究结果相吻合[23]。镰刀菌根腐病发病烟株根际真菌群落多样性的降低，很可能是镰刀菌在群落的种间竞争中占据优势，少数病原菌不断积累并逐渐成为优势种，在这个过程中，相应的部分有益菌因为竞争能力弱而被淘汰[24]，物种数减少，多样性降低。

除群落组成和多样性外，镰刀菌根腐病发病烟株与未发病烟株根际真菌的营养型组成也存在显著差异。在未发病烟株根际，真菌以腐生营养型为主，病理营养型次之，而发病烟株根际真菌的营养型则以病理营养型为主，腐生营养型次之。病理营养型表示真菌通过伤害寄主细胞来获取自身所需的营养物质，而腐生营养型则表示真菌通过分解死亡的寄主细胞来获取营养物质[25]。镰刀菌根腐病发病烟株根际的病理营养型真菌显著高于未发病植株，说明发病植株根际可能有更多的致病真菌，尤其是镰刀菌，通过破坏根系细胞来维持自身生长，导致烟株根系组织遭到破坏，进而使病原菌能更加顺利地从根系对烟株进行侵染，最终导致烟株发病。

分析结果显示，发病烟株根际的病原菌相对丰度也显著高于未发病烟株，2个镰刀菌在发病烟株根际的病原菌中占据绝对的优势地位。镰刀菌是烟草致病菌，可引发烟草的镰刀菌根腐病[26]。其中，尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、茄病镰刀菌（F.solani）等是侵染烟草根系并引发根腐病的主要病原菌种[26-27]，主要通过伤害烟草的维管束组织和根系组织等来侵染烟草[27]。因此，联合使用高通量测序与FUNGuild软件，可以对土传病害感病烟株的根际优势病原真菌群落进行准确的鉴定，同时也可提供丰富的、非优势的潜在病原真菌信息，这对揭示烟草土传病害发生的土壤微生物学机理具有重要意义，也可为烟草土传病害的防控提供科学参考。

4 结论

通过高通量测序与FUNGuild的联合使用，对镰刀菌根腐病发病烟株与未发病烟株根际土壤中的真菌群落进行了研究，结果表明：（1）未发病烟株与发病烟株根际的真菌群落在组成上具有显著差异，未发病烟株根际真菌多样性显著高于发病烟株；（2）发病烟株根际真菌的营养型以病理营养型为主，腐生营养型次之，而未发病烟株则正好相反；（3）发病烟株根际的病原菌相对丰度显著高于未发病烟株，镰刀菌在病原菌群落中占绝对优势地位。高通量测序与FUNGuild的联用，可以对土传病害感病烟株的根际优势病原真菌群落进行准确的鉴定，也可为烟草土传病害的防控提供科学参考。